一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示引物对和SEQ ID NO.3所示探针的用于牦牛源性成分检测的试剂盒，还涉及用于检测牦牛源性成分的方法。本发明专利技术试剂盒及方法可以准确检测肉及肉制品中的牦牛源性成分，检测快速、准确，成本低，特异性好，灵敏度高，有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒和方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒和方法。
技术介绍
近年来，伴随着肉类市场的急剧扩大，肉类掺假的事件频频发生，掺假的方式越来越多，形式越来越复杂，已成为全球食品行业的一个突出问题。肉制品掺假不仅会引起个体的健康风险，包括疾病感染、代谢紊乱、过敏反应等，而且肉制品的掺假更易引起经济、宗教、道德的问题。目前，肉类掺假常见的检测技术有ELISA法、显微判定法、电子鼻法、质谱法等，但都存在灵敏度低、周期长、不能检测熟肉等缺点而未被广泛使用。PCR技术具有灵敏度高、操作简便、抗干扰能力强等优势，越来越多被用于动物源性成分检测。现有标准《SNT4397-2015出口食品中牦牛源性成分的检测方法实时荧光PCR法》是利用了荧光PCR方法检测牦牛源性成分，但仅可用于出口食品，而且我们在检测过程中发现，该方法对猪肉成分会出现假阳性，无法保证判定结果的准确性。公开号为CN102634581A的专利申请公开了一种牦牛源性纤维成分的荧光定量PCR方法，其仅针对牦牛毛发进行PCR扩增，而且引物序列不够特异，导致检测结果判定模糊，无法做出准确判定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒和方法。本专利技术提供了SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对、SEQIDNO.3所示的探针。本专利技术还提供了SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对和SEQIDNO.3所示的探针在制备检测牦牛源性成分的试剂中的用途。其中，所述试剂是检测肉及肉制品中牦牛源性成分的试剂。本专利技术还提供了一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒，它包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对和SEQIDNO.3所示的探针。其中，它还包括实时荧光PCR预混液。其中，它还包括TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP和反应缓冲液。其中，所述试剂盒的组成为：PCR反应总体积为20μL时，其中，模板DNA的浓度为1ng/μL～100ng/μL；引物的浓度为10μmol/L；探针的浓度为10μmol/L。本专利技术还提供了上述试剂盒在用于检测肉及肉制品中牦牛源性成分中的用途。本专利技术还提供了一种检测牦牛源性成分的方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)提取样本DNA：取待检样品，提取其中的DNA；(2)基因扩增：用上述试剂盒对待检样品中的DNA进行扩增；(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测；其中，所述待检组织为肉及肉制品；综上，本专利技术试剂盒及方法可以准确检测牦牛源性成分，特别适用于肉及肉制品中的牦牛源性成分检测，，检测快速、准确，成本低，特异性好，灵敏度高，有广泛的应用前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1牦牛源性成分的特异性验证图。图2牦牛源性成分的适用性验证图。图3牦牛源性成分DNA浓度与Ct值关系图。图4牦牛源性成分灵敏度验证图。图5牦牛源性检出限验证图。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。本专利技术所用的实验试剂与仪器，均可通过商业途径购买得到。具体试剂如下：(1)CTAB裂解液：2％(w/v)CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，用10％盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，备用。(2)蛋白酶K：20mg/mL。(3)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)。(4)异丙醇。(5)70％乙醇。(6)实时荧光PCR预混液(以2×预混液为例)：PCR缓冲液(终浓度1×)，氯化镁(终浓度2.5mmol/L)，dNTP(终浓度0.2mmol/L)，TaqDNA聚合酶(终浓度1U)。(7)TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。具体仪器如下：(1)电子天平(SartoriusCPA225D)，感量0.01g。(2)组织捣碎器(RetschMM400)。(3)恒温水浴锅(精宏XMTD-8222)。(4)离心机(EppendorfCentrifuge5810R)，最大离心力≥12000g。(5)微量移液器(EppendorfResearchplus)，量程分别为0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。(6)pH计(MettlerToledoFE20)。(7)核酸蛋白分析仪(ImplenP330)。(8)实时荧光PCR仪(Bio-RadCFX96)。实施例1本专利技术检测牦牛源性成分的试剂盒和检测方法一、本专利技术试剂盒成分包含SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对和SEQIDNO.3所示的探针；如表1所示：表1本专利技术引物及探针注：F为5’端引物，R为3’端引物，P为探针。二、采用本专利技术试剂盒检测牦牛源性成分1、DNA提取将样品均质后称取0.1g～0.2g，置于2mL离心管中，加入600μLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃孵育1h～2h，期间每隔10min振荡混匀；加入500μL的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，充分振荡混匀，12000g离心5min；小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000g离心5min；弃去上清液，500μL70％乙醇洗涤2次，12000g离心5min，弃上清液，晾干；加入50μL～100μLTE缓冲液或无菌双蒸水，溶解DNA，-20℃保存备用。也可用等效商品化试剂盒提取DNA。2、DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，DNA浓度在1ng/μL～100ng/μL之间，A260/A280值在1.7～2.0之间时，适宜于本方法。3、实时荧光PCR扩增牦牛源性成分PCR扩增采用20μL的反应体系：包括PCR反应预混液(2×)10μL，5’端、3’端引物(10μmol/L)各0.2μL，探针(10μmol/L)0.1μL，DNA模板(1ng/μL～100ng/μL)1μL，用无菌双蒸水补足20μL。每个样品设置两个平行反应体系。PCR扩增反应程序为：95℃5min；35个循环反应(95℃15s，58℃1min，收集荧光)。也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。4、实验对照实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用含有牦牛源性成分的样品作为阳性对照，用牦牛源性成分的样品作为阴性对照，用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。5、结果判断与表述：5.1质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤30.0。5.2结果判定(a)如有FAM荧光信号检出，Ct值≤30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对。2.SEQIDNO.3所示的探针。3.SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对和SEQIDNO.3所示探针在制备检测牦牛源性成分的试剂中的用途。4.根据权利要求3所示的用途，其特征在于：所述试剂是检测肉及肉制品中牦牛源性成分的试剂。5.一种用于检测牦牛源性成分的试剂盒，其特征在于：它包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的引物对和SEQIDNO.3所示的探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包括实时荧光PCR预混液。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包括TaqDNA聚合酶、MgCl2、d...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，段庆梓，杜凤，梁恒兴，陈浩东，黄春燕，陈蓉，张彪，董娟，张玉，尚柯，王巍，吴文林，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，成都市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：四川,51