一种膀胱癌干细胞鉴定的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其包括检测KMT1A基因表达的试剂。本发明专利技术还公开了筛选或鉴定膀胱癌干细胞的方法以及检测KMT1A基因表达试剂的应用。与正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞和膀胱癌非干细胞相比，KMT1A基因仅在膀胱癌干细胞中高表达，因此上述试剂盒灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种膀胱癌干细胞鉴定的试剂盒及其应用
本专利技术总地涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及筛选或鉴定肿瘤干细胞的试剂盒与方法以及检测KMT1A基因表达试剂的应用。
技术介绍
膀胱癌是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。在我国，膀胱癌的发病率为6.61/10万，在泌尿系统肿瘤中排第一位。膀胱癌发生的危险因素主要包括吸烟、芳香胺类致癌物、砒霜、膀胱的慢性感染、电离辐射和非那西汀类药物的滥用。根据病理特征，膀胱癌在临床上分为浅表型(70％)和浸润型(30％)两大类。极易复发是膀胱癌最大的临床问题。近年来，肿瘤干细胞学说受到肿瘤研究者的高度关注和认同。肿瘤干细胞假说认为肿瘤中存在着一小部分具有类似干细胞功能的细胞，其具有自我更新和可塑性潜能，在肿瘤形成和生长中起着决定性作用。最新的研究已证明，肿瘤干细胞存在于乳腺癌、肝癌和白血病等多种癌症中，其具有极强的致瘤、耐药和转移能力。现有的治疗措施尚无法针对肿瘤干细胞发挥作用，这可能是导致肿瘤耐药和复发的主要原因。目前已经报道的膀胱癌干细胞的标志物包括基底层细胞标志物CK5、CK14、CK17、67kD层黏连蛋白受体(67LR)、CD44、CD47和CD90。上述膀胱癌干细胞的标志物，在正常膀胱干细胞中也高表达，不是膀胱癌治疗的理想靶点。相比较于膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞，尚无膀胱癌干细胞特异的标志物。因此，亟需开发和鉴定高特异性的标志物用于膀胱癌干细胞的鉴定。
技术实现思路
为了解决上述问题，专利技术人利用表达谱芯片技术，通过分析膀胱癌干细胞和非干细胞表达差异的基因，筛选出在人膀胱癌干细胞和人膀胱癌干细胞球中显著高表达的基因——组蛋白甲基转移酶KMT1A。KMT1A的转录区域位于X染色体，其mRNA全长1272bp。与膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞相比，KMT1A的mRNA和蛋白表达水平仅在膀胱癌干细胞中显著高表达。KMT1A基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。据此，本专利技术提供了鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒及检测KMT1A基因表达试剂的应用。本专利技术的第一方面提供一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其包括检测KMT1A基因表达试剂。优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1A基因表达试剂为检测KMT1AmRNA或KMT1A蛋白的试剂。更优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1AmRNA的试剂为Northern-blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂。优选地，所述检测KMT1AmRNA的试剂包括扩增KMT1AmRNA或其反转录的cDNA的特异性引物对。更优选地，所述扩增KMT1AmRNA反转录的cDNA的特异性引物对如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。再优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如SEQIDNO.1所示的引物、SEQIDNO.2所示的引物、PCR反应液和标记物，所述标记物为荧光染料SYBR或探针。优选地，所述PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶和PCR缓冲液，所述荧光染料SYBR为SYBRGreenII，所述探针为TaqMan探针、分子信标、双杂交探针或复合探针。其中，所述试剂盒还可以包括作为阳性对照的KMT1ADNA模板。或更优选地，根据上述的试剂盒，其中，所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂。优选地，所述检测KMT1A蛋白的试剂包括KMT1A抗体。本专利技术的第二方面提供一种筛选或鉴定膀胱癌干细胞的方法，所述方法包括：ⅰ)检测测试样品中KMT1A基因的表达，ⅱ)步骤ⅰ)的检测结果与对照样品中KMT1A基因的表达或与预定的参照标准进行比较，ⅲ)通过步骤ⅱ)的比较结果筛选或鉴定膀胱癌干细胞。本专利技术的第三方面提供检测KMT1A基因表达的试剂在制备筛选或鉴定膀胱癌干细胞的产品中的应用。优选地，根据上述的应用，其中，KMT1A基因的表达量与膀胱癌细胞的存在相关，所述膀胱癌细胞优选为膀胱癌干细胞。更优选地，根据上述的应用，其中，筛选或鉴定膀胱癌干细胞包括：检测测试样品中KMT1A基因的表达；检测结果与对照样品中KMT1A基因的表达或与预定的参照标准进行比较；通过比较结果筛选或鉴定膀胱癌干细胞。其中，测试样品和对照样品可以为通过活组织检查获得的组织块，优选为组织切片或细胞。其中，所述对照样品可以是膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞的样品，或来自经诊断为未患有膀胱癌的患者的样品。所述参照标准可以是参照值，也可以是参照范围，其可以基于经检测为膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞的KMT1A基因的表达量进行确定，可以基于经诊断未患有膀胱癌的患者的KMT1A基因的表达量进行确定，可以基于经检测为膀胱癌干细胞的KMT1A基因的表达量进行确定，也可以基于经诊断患有膀胱癌的患者的KMT1A基因的表达量进行确定。在一个实施方案中，上述筛选或鉴定膀胱癌干细胞包括：ⅰ)检测测试样品中KMT1A基因表达；ⅱ)检测对照样品中KMT1A基因表达；ⅲ)比较步骤ⅰ)和步骤ⅱ)的检测结果以判断所述测试样品是否为膀胱癌干细胞。在一个实施方案中，上述筛选或鉴定膀胱癌干细胞采用荧光定量PCR检测方法测试样品和对照样品的KMT1A基因表达，具体包括以下步骤：ⅰ)提取测试样品和对照样品的总RNA；ⅱ)将步骤ⅰ)提取的总RNA分别反转录合成cDNA；ⅲ)以ⅱ)合成的cDNA为模板分别进行荧光定量PCR扩增以获得Ct值；ⅳ)通过对照样品的Ct值确定参照标准，所述参照标准可以为对照样品的Ct值平均数或Ct值平均数的置信区间的上下限，所述置信区间优选为95％的置信区间；ⅴ)通过比较测试样品的Ct值和参照标准以判断测试样品是否为膀胱癌干细胞。再优选地，根据上述的应用，其中，所述检测KMT1A基因表达的试剂为定量和/或定性检测KMT1A基因表达的试剂。或再优选地，根据上述的应用，其中，所述检测KMT1A基因表达的试剂为检测KMT1AmRNA或KMT1A蛋白的试剂。优选地，所述检测KMT1AmRNA的试剂为Northern-Blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂，所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂。本专利技术利用KMT1A鉴定膀胱癌干细胞的方法特异性强，因为与正常膀胱干细胞、正常膀胱非干细胞和膀胱癌非干细胞相比，KMT1A仅在膀胱癌干细胞中高表达。本专利技术为膀胱癌干细胞的鉴定提供新的方法，并为膀胱癌的靶向治疗提供新的治疗靶点。本专利技术提供的鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。附图说明图1为实施例1中利用荧光定量PCR的方法，在膀胱癌干细胞、膀胱癌非干细胞、正常膀胱干细胞和正常膀胱非干细胞中检测KMT1A基因的表达量，*为P<0.05，**为P<0.01；图2为实施例2中利用荧光定量PCR的方法，膀胱癌干细胞与膀胱癌非干细胞中检测KMT1A基因的表达量，其中小球为膀胱癌干细胞，非小球为膀胱癌非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其特征在于，其包括检测KMT1A基因表达的试剂。

【技术特征摘要】
2017.07.18 CN 20171058531651.一种鉴定膀胱癌干细胞的试剂盒，其特征在于，其包括检测KMT1A基因表达的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测KMT1A基因表达的试剂为检测KMT1AmRNA或KMT1A蛋白的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测KMT1AmRNA的试剂为Northern-blot检测方法用试剂、原位杂交检测方法用试剂、表达谱芯片检测方法用试剂或荧光定量PCR检测方法用试剂，优选地，所述检测KMT1AmRNA的试剂包括扩增KMT1AmRNA或其反转录的cDNA的特异性引物对，更优选地，所述扩增KMT1AmRNA反转录的cDNA的特异性引物对如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述检测KMT1A蛋白的试剂为Western-Blot检测方法用试剂、免疫染色检测方法用试剂或ELISA检测方法用试剂，优选地，所述检测KMT1A蛋白的试剂包括KMT1A抗体。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQIDNO.1所示的引物、SEQIDNO.2所示的引物、PCR反应液和标记物，所述标记物为荧光染料SYBR或探针；优选地，所述PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶和PCR缓冲液，所述荧光染料SYBR为SYBRGreenII，所述探针为TaqMan探针、分子信标、双杂交...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨昭，温廷益，李翀，邓爱华，商秀玲，徐银燕，何璐云，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11