一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法，属于细胞和分子生物技术领域。本发明专利技术通过在SCA3/MJD患者血浆及脑脊液外泌体中提取总RNA，应用Small RNA Sequencing（sRNA seq）筛选和鉴定差异性表达的miRNAs，并结合实时荧光定量PCR（Quantitative Real‑time PCR,qPCR）验证，证实了novel‑mir‑7014可作为指导SCA3/MJD临床分型及反映疾病严重程度潜在的生物标志物，将为SCA3/MJD提供一种新的特异性的辅助诊断方法，在病情监测及辅助治疗上有潜在的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法
本专利技术涉及细胞和分子生物
，特别涉及一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法。
技术介绍
遗传性脊髓小脑性共济失调（spinocerebellarataxias，SCAs）是一类常见的神经系统退行性疾病，尤其以脊髓小脑性共济失调3型/马查多-约瑟夫病（spinocerebellarataxiatype3/Machado-Josephdisease,SCA3/MJD）最常见，在中国人群中该型几乎占SCAs患者的60-70%。有学者将SCA3/MJD分为以下5种亚型:1型：通常在20岁之前发病，进展迅速，以锥体束征(肌强直和肌痉挛)和锥体外系特征(运动迟缓和肌张力障碍)合并共济失调为主要表现；2型通常在20-50岁之间发病，以共济失调伴进行性眼外肌麻痹及锥体束征为主要表现；3型发病较晚，发病年龄多见于40-75岁之间，以共济失调合并周围神经表现如运动神经病变及肌肉萎缩为主要特征；此外还有以帕金森症状为特点的4型及纯粹痉挛性截瘫为临床表现的5型。在这五个亚型中，2型最常见，其次是较为少见的3型、1型，4和5更为罕见。SCA3/MJD的致病基因ATXN3的编码区内含有CAG重复序列，正常人的拷贝数约13-40，而患者因发生动态突变可扩增至51-86。除CAG重复序列拷贝数变异可解释患者50-60%的临床异质性外，修饰基因、表观遗传等因素也参与了调节。ATXN3基因编码蛋白—ataxin-3的羧基端含一段多聚谷氨酰胺（polyglutamine,polyQ）肽链，含有异常扩展polyQ肽链的ataxin-3蛋白可选择性在神经系统特定区域（小脑、脑干、脊髓等）积聚形成神经元核内包涵体并引起细胞死亡。由于其发病、临床分型、疾病进展等相关机制尚未完全阐明，尚无特效的治疗，致死率和致残率高，给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。外泌体（exosomes）作为备受关注的细胞间通讯媒介，为该类疾病的临床分型、疾病严重程度及可能发病机制等的探讨提供了新的思路。外泌体是由多种活细胞分泌的直径40-150nm的胞外囊泡，在脑脊液、血浆、尿液等体液都可以检测到外泌体的存在。外泌体包含非编码RNAs（miRNAs、lncRNAs等）、mRNAs、蛋白质等成分，可转运这些成分作用于靶细胞，发挥相应调控作用，是一种非常重要的细胞间物质和信息交流的载体。外泌体形态较小，易透过血脑屏障，存在免疫豁免，并能随体液转运而不易被吞噬细胞吞噬，具有检测损伤小、稳定性好、灵敏度高等诸多优点，提示外泌体可作为神经退行性疾病新的生物标志物及潜在的治疗载体的研究方向。综上所述，寻求一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物对辅助诊断和早期治疗SCA3/MJD具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的关键技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物及其筛选鉴定方法，为临床上SCA3/MJD早期诊断、早期治疗提供支持。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物，所述外泌体生物标志物为外泌体来源的含有如SEQID.1所示的核苷酸序列的miRNA。进一步，所述miRNA为外泌体来源的novel-mir-7014。进一步，一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法，包括以下步骤：1）收集血浆、脑脊液样本，并提取样本中的外泌体及外泌体RNAs，并鉴定外泌体；2）应用sRNAseq技术对步骤1）提取得到的外泌体smallRNAs进行测序，并筛选出差异性表达的miRNAs；3）扩大收集血浆样本，并提取样本中的外泌体RNAs；4）采用qPCR分析方法检测miRNAs的相对表达水平，对筛选的miRNAs进行验证性评估。进一步，所述用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法，在步骤2）和3）之间还包括对novel-mir-7014进行GO注释和KEGG代谢通路分析。进一步，一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法，步骤4）中qPCR分析方法的具体操作为：a）制备逆转录的反应混合液，将miRNAs逆转录为cDNAs；b）通过Primer5设计引物；c）制备qPCR反应体系，用U6作为标准化内参，进行实时荧光定量PCR分析，采用-△CT法进行miRNAs的相对表达含量分析。进一步，所述novel-mir-7014的正向引物的序列为CCTGTGTTCCTGAGCCTTG。进一步，用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物在制备SCA3/MJD辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法的有益效果：高效筛选并鉴定了novel-mir-7014为SCA3/MJD外泌体来源的差异性表达的miRNAs，可作为指导SCA3/MJD临床分型及反映疾病严重程度潜在的生物标志物，为临床诊断SCA3/MJD提供一种新的特异性的辅助诊断方法，在病情监测及辅助治疗上有潜在的临床应用价值。附图说明图1—为一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法的流程示意图；图2—为外泌体鉴定的电子显微镜图；图3—为外泌体鉴定的纳米粒径图；图4—为一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的结构图；图5—为GO注释差异表达基因novel-mir-7014的靶基因的分类图；图6—为KEGG分析差异表达基因novel-mir-7014的靶基因的分类图；图7—为KEGG分析差异表达基因novel-mir-7014的靶基因通路富集图；图8—为KEGG分析差异表达基因novel-mir-7014参与内质网的蛋白质加工代谢通路图；图9—为KEGG分析差异表达基因novel-mir-7014参与轴突导向神经系统代谢通路图；图10—为qPCR验证的miRNA的表达图。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本专利技术的保护范围。实施例1本实施例1筛选与SCA3/MJD相关的差异性表达的miRNAs，具体操作过程为：1.样本收集：12例SCA3/MJD患者（包括3种亚型：3例1型，6例2型，3例3型）的血浆样本和12例年龄、性别相匹配的健康人的血浆样本为对照组；12例SCA3/MJD患者（包括3种亚型：3例1型，6例2型，3例3型）的脑脊液样本和10例年龄、性别相匹配的动脉瘤/偏头痛患者的脑脊液样本为对照组。血浆样本：用抗凝管采集SCA3/MJD患者及对照组全血10ml，3000rpm4℃离心15min，分离血浆备用，2小时内完成。脑脊液样本：用无菌离心管采集SCA3/MJD患者及对照组脑脊液10-15ml备用，2小时内完成。2.外泌体、外泌体RNA的提取及外泌体的鉴定（1）采用exoEasyKit试剂盒的方法提取外泌体，采用exoRNeasySerum/PlasmaKit试剂盒的方法提取外泌体RNA。（2）外泌体的鉴定：采用电镜观察外泌体的形态，应用纳米粒子追踪分析进行粒径分布检测，鉴定外泌体。电镜观察：应用透射电镜(TecnaiG2Spirit本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物，其特征在于，所述外泌体生物标志物为外泌体来源的含有如SEQ ID.1所示的核苷酸序列的miRNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物，其特征在于，所述外泌体生物标志物为外泌体来源的含有如SEQID.1所示的核苷酸序列的miRNA。2.如权利要求1所述用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物，其特征在于，所述外泌体生物标志物为外泌体来源的novel-mir-7014。3.如权利要求1或2所述的用于辅助诊断SCA3/MJD的外泌体生物标志物的筛选鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1）收集血浆、脑脊液样本，并提取样本中的外泌体及外泌体RNAs，并鉴定外泌体；2）应用sRNASeq技术对步骤1）提取得到的外泌体SmallRNAs进行测序，并筛选出差异性表达的miRNAs；3）扩大收集血浆样本，并提取样本中的外泌体RNAs；4）采用qPCR分析方法检测miRNAs的相对表达水平，对筛选的miRNAs进行验证性评估。4.如权利要求3所述用于辅助诊断SCA3/MJ...

【专利技术属性】
技术研发人员：江泓，侯晓灿，陈召，裘嵘，唐北沙，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43