一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法及应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供的大鼠BMPR2基因突变敲入的识别序列在基因编辑载体的辅助下，能精确识别BMPR2基因的核酸序列，通过将载体体外转录后注射到受精卵中，再通过受精卵移植，得到基因编辑的子代大鼠，然后通过合笼交配，得到子二代大鼠。该大鼠模型经过低压低氧诱导，表现出接近人类疾病表型的、严重的肺动脉高压，具有较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法及应用
本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法及应用。
技术介绍
肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，PAH)病理机制复杂，预后极差，5年生存率仅为57％(Chest2012，142：448-456)。遗传性肺动脉高压(heritablepulmonaryarterialhypertension，HPAH)是指由特定致病基因突变所导致的肺动脉高压。目前，已经发现7个PAH致病基因，分别是骨形成蛋白受体2(BoneMorphogeneticProteinReceptor2，BMPR2)、骨形成蛋白受体1B(BMPR1B)、活化素受体类激酶1(ACVRL1/ALK1)、血管细胞粘附分子(Endoglin，ENG)、Smad蛋白9(SMAD9)、小窝蛋白1(CAV1)以钾离子通道蛋白3(KCNK3)。BMPR2是目前已知的最主要的HPAH致病基因，在特发性肺动脉高压中占比20-40％，在家族性肺动脉高压中占比50-80％。相比于不携带BMPR2基因突变的PAH患者，携带突变的患者临床表型更重，治疗更困难，患者预后更差，死亡风险更高。因此，HPAH已经成为严重威胁人类健康的重要疾病，给家庭和社会带来承重的负担。。一个能够真实模拟HPAH疾病进程、复制疾病表型的动物模型是探索HPAH疾病机制、研发新型药物的重要前提，但现有的肺动脉高压动物模型均不能实现以上目的，存在的主要问题如下：1)目前常用肺动脉高压大鼠模型，无论是野百合碱(monocrotaline,MCT)和缺氧诱发肺动脉高压，还是缺氧联合VEGF抑制剂SU5416诱导肺动脉高压，均是由明确的环境或药物刺激所诱发的肺动脉高压，不能真实模拟基因突变导致的肺动脉高压疾病进程和疾病表型。2)现有的小鼠模型大多以BMPR2基因敲除为主(包括全身敲除、内皮细胞特异性敲除)，部分小鼠为转基因过表达突变型BMPR2基因，这与真实世界中PAH患者携带BMPR2基因杂合突变的情况并不吻合，也无法反映超过一半以上患者携带BMPR2错义突变的情况。3)既有的BMPR2基因修饰小鼠不能很好的模拟患者的临床病理表型。绝大多数小鼠模型无自发性PAH，个别模型(BMPR2+/-)小鼠在基线水平表现轻度的PAH并出现肺动脉的增厚，但肺血管压力升高的程度较轻，右心室肥厚表型亦不明显。绝大多数小鼠模型即便在缺氧刺激下，肺血管阻力也只是中等程度的升高。无一个小鼠模型表现出PAH患者肺血管丛样病变的特性。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法，该方法能制备出高度模拟和复制肺动脉高压疾病模型。本专利技术的第二目的在于提供上BMPR2基因突变大鼠的制备方法制备得到的BMPR2基因突变大鼠在筛选治疗遗传性肺动脉高压药物中的应用。本专利技术的第三目的在于提供上述的BMPR2基因突变大鼠的制备方法制备得到的BMPR2基因突变大鼠在筛选治疗诱发性肺动脉高压药物中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，采用以下技术方案：一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法，突变大鼠BMPR2基因，突变位点为c.C1471T。上述的BMPR2基因突变大鼠的制备方法制备得到的BMPR2基因突变大鼠在筛选治疗遗传性肺动脉高压药物中的应用。上述的BMPR2基因突变大鼠的制备方法制备得到的BMPR2基因突变大鼠在筛选治疗诱发性肺动脉高压药物中的应用。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果包括：1)BMPR2基因突变敲入大鼠携带BMPR2杂合型突变，是对人类遗传性肺动脉高压患者发病基础的完全模拟；2)在低压低氧诱导下，BMPR2基因突变敲入大鼠表现出更加严重的肺动脉高压表型以及更接近人类肺血管重构的病理表型，是对人类遗传性肺动脉高压患者疾病表型的更好模拟；3)BMPR2基因突变敲入大鼠的疾病表型稳定，是研究遗传性以及诱发性肺动脉高压病理机制、筛选新型药物的良好模型。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实验例提供的模型大鼠敲除基因测序结果示意图；图2为本专利技术实验例提供的大鼠右心室收缩压结果示意图；图3为本专利技术实验例提供的大鼠右心室游离壁厚度实验结果图；图4为本专利技术实验例提供的大鼠三尖瓣环位移图；图5为本专利技术实验例提供的大鼠右心肥厚指数结果图；图6为本专利技术实验例提供的肺组织肌化小血管染色结果示意图；图7为本专利技术实验例提供的肺组织小血管示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法及应用进行具体说明。一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法，突变大鼠BMPR2基因，突变位点为c.C1471T。进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，包括以下步骤：合成碱基序列分别如SEQIDNo.1-2所示的识别序列，并通过退火复性成识别片段；将识别片段与经过酶切处理的线性化载体连接，得到Cas9-BMPR2-RNA重组载体，将Cas9-BMPR2-RNA重组载体转录并注射受精卵，得到注射受精卵；将SD雌鼠与结扎过的SD雄鼠交配，并选取见栓的SD雌鼠，并将注射受精卵移植到见栓的SD雌鼠的壶腹部，得到Founder大鼠；将Founder大鼠与野生型SD大鼠进行交配得到F1代大鼠并筛选得到F1代Bmpr2+/R491W大鼠；将F1代Bmpr2+/R491W大鼠分为雄性杂合突变鼠和雌性杂合突变鼠，将雄性杂合突变鼠和雌性杂合突变鼠分别与野生型大鼠按比例合笼交配，得到BMPR2突变敲入F2代鼠；将BMPR2基因敲入模型鼠在低压低氧诱导2-3周得到接近人类疾病表型的、严重的肺动脉高压模型鼠。近6年来已经完成670名PAH患者的遗传检测，发现144名患者携带BMPR2基因突变，其中c.C1471T(p.R491W)是中国人热点突变，突变频率高达9.3％。进一步的，我们在法国国家肺血管病中心的数据库中验证发现，R491W也是法国人的热点突变，占比6％。因此，我们确定R491W为中西方共有的热点突变；该识别序列针对BMPR2基因c.C1471T(p.R491W)位点进行修饰，得到肺动脉高压模型鼠。我们利用CRISPR/Cas9技术制作了BMPR2基因p.R491W突变敲入大鼠模型。该大鼠模型经过低压低氧诱导，表现出接近人类疾病情况的、严重的肺动脉高压表型。我们的专利技术将为研发BMPR2突变致病的病理机制、研发新型药物提供重要的模型鼠，具有较高的应用价值。识别序列包括SEQIDNO.1，即sgRNA：R-bmpr2-gRNAup35’TAGGgaccaggatgcagaggct；SEQIDNO.2，即R-bmpr2-gRNAdo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法，其特征在于，突变大鼠BMPR2基因，突变位点为c.C1471T。

【技术特征摘要】
1.一种BMPR2基因突变大鼠的制备方法，其特征在于，突变大鼠BMPR2基因，突变位点为c.C1471T。2.根据权利要求1所述的BMPR2基因突变大鼠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：合成碱基序列分别如SEQIDNo.1-2所示的识别序列，并通过退火复性成识别片段；将所述识别片段与经过酶切处理的线性化载体连接，得到Cas9-BMPR2-RNA重组载体，将所述Cas9-BMPR2-RNA重组载体转录并注射受精卵，得到注射受精卵；将SD雌鼠与结扎过的SD雄鼠交配，并选取见栓的所述SD雌鼠，并将所述注射受精卵移植到见栓的所述SD雌鼠的壶腹部，得到Founder大鼠；将所述Founder大鼠与野生型SD大鼠进行交配得到F1代大鼠并筛选得到F1代Bmpr2+/R491W大鼠；将所述F1代Bmpr2+/R491W大鼠分为雄性杂合突变鼠和雌性杂合突变鼠，将所述雄性杂合突变鼠和所述雌性杂合突变鼠分别与野生型大鼠按比例合笼交配，得到BMPR2基因突变敲入F2代鼠；将所述BMPR2基因突变敲入模型鼠在低压低氧诱导2-3周得到接近人类疾病表型的、严重的肺动脉高压模型鼠。3.根据权利要求2所述的BMP...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆志成，王晓建，李素琪，程春燕，吕子超，刘少飞，张思瑾，谭元卿，周玉平，刘倩倩，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，保定市长征心肺血管病研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11