一种双重固定化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于固定化酶领域，公开了一种利用原位自由基聚合技术和碳纳米材料对酶进行双重固化的方法。该方法首先将碳纳米材料分散于磷酸盐缓冲溶液中得到碳纳米管分散液；再配制酶溶液，采用原位自由基聚合技术对酶分子进行修饰保护，得到酶纳米胶囊溶液；然后向碳纳米材料分散液中添加酶纳米胶囊溶液，混匀后静置；最后将混合液分离，洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。这种双固定化酶体系以酶纳米胶囊为基本单元，与传统的固定化酶相比，酶分子表面修饰了一层聚合物层，因而极大的提高了酶分子的稳定性。本发明专利技术得到的双重固定化酶保留了较高的酶活力，且具有比游离酶和传统固定化酶更高的环境稳定性和重复使用性能。

【技术实现步骤摘要】
一种双重固定化酶及其制备方法和应用
本专利技术属于固定化酶领域，特别涉及一种利用原位自由基聚合技术和碳纳米材料制备双重固定化酶的方法及应用。
技术介绍
酶是具有催化活性和高度选择性的特殊有机物，其中大多数酶的化学本质为蛋白质。受限于蛋白质自身的特性，酶对环境的变化十分敏感，高温、高压、重金属离子以及过高或过低的pH均可能会使酶丧失活力。因而，对天然酶分子进行固定化，以提高酶的结构稳定性，使其稳定地发挥催化作用就显得很有必要。传统的固定化酶方法主要包括物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等。要获得理想的固定化酶，提高固定化酶的活力和稳定性，既要选用高效的固定化方法，又要有理想的固定化载体。作为一种理想的酶固定化载体，碳纳米材料具有稳定的物理性质和优良的生物相容性。一方面，碳纳米材料稳定的物理性质保证了其在环境中具有更稳定的结构，与壳聚糖、海藻酸盐、纤维素纳米晶、多孔淀粉等有机载体相比，其在环境中不被微生物降解，给酶提供了良好的附着载体；另一方面，对比二氧化硅、玻璃、硅藻土等无机材料，其优良的生物相容性可以最大程度的保留酶的活力而对环境的影响甚小。原位自由基聚合技术被广泛应用于蛋白质药物的靶向输送和稳态化。该方法是在分子水平上对酶蛋白进行修饰，通过原位自由基聚合技术在酶分子表面聚合生成聚合物膜，得到酶纳米胶囊。这种聚合物膜共价锚定于酶分子的表面，可以稳定酶分子的构象，降低外界环境对酶分子的影响。碳纳米材料特殊的结构和性能使之成为理想的酶固载材料，采用碳纳米材料固定化酶在化工生产，清洁能源开发，药物靶向输送和生物传感器制备等方面具有广泛的应用前景，然而如何进一步提高酶分子在碳材料上的固载量和稳定性是研究人员一直所面临的问题，大量的研究报道集中于选择不同的交联剂亦或是采用化学键合的方法将酶固定于碳材料上，但这些方法对于不同的碳材料和酶的固定化效果差异较大，并且得到的固定化酶活力也往往很难令人满意。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种双重固定化酶的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述方法制备的双重固定化酶。本专利技术的另一目的在于提供上述的双重固定化酶在催化方面的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种双重固定化酶的制备方法，主要包括以下步骤：(1)将碳纳米材料均匀分散于pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液中，得到碳纳米材料分散液；(2)将酶加入到pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中形成酶溶液，向酶溶液中添加修饰剂，混合均匀并发生酶修饰反应，反应结束后再向其中添加单体、交联剂，然后再在无氧条件下添加引发剂和催化剂，引发原位聚合反应，反应结束后将所得反应液纯化即得到酶纳米胶囊溶液；(3)向步骤(1)中的碳纳米材料分散液中添加步骤(2)制备的酶纳米胶囊溶液，混匀后放入冰箱中静置，最后将混合液分离、洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。步骤(1)中所述的碳纳米材料优选为石墨烯，氧化石墨烯，还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纤维、碳纳米球中的一种或几种混合，优选为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管中的一种或几种混合；步骤(1)中所述的分散指采用搅拌或超声中的至少一种方式进行分散，优选采用机械搅拌并结合超声处理1～5h进行分散，其中机械搅拌的速度为100～1000r/min，超声功率为100～200W；更优选为采用机械搅拌并结合超声处理2h进行分散，其中机械搅拌的速度为600r/min，超声功率为100W。步骤(1)中所述的碳纳米材料分散液的浓度为1～10mg/mL；步骤(2)中所述的酶包括但不限于有机磷水解酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶、漆酶、甲酸脱氢酶，甲醛脱氢酶，甲醇脱氢酶，葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖异构酶，苹果酸酶和丙氨酸脱氢酶等。优选的，步骤(2)中所述的酶为有机磷水解酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶中的至少一种；步骤(2)中所述的酶溶液指浓度为1～10mg/mL的酶溶液；步骤(2)中所述的修饰剂为丙烯酸、丙烯酸盐类化合物和丙烯酸酯类化合物中的至少一种，优选为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、丙烯酸钠(AAS)、丙烯酸(AA)中的至少一种；步骤(2)中所述的酶修饰反应是指在4～30℃反应2～10h。步骤(2)中所述的单体为具有可发生聚合反应的不饱和化学键的单体，如含有碳碳双键的苯乙烯、丙烯酰胺、丙烯酸酯类化合物、甲基丙烯酸酯类化合物、丙烯酸盐类化合物、甲基丙烯酸盐类化合物等；或者具有共轭双键结构的吡咯、噻吩、吡啶等中的至少一种；优选的，步骤(2)中所述的单体为丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)-甲基丙烯酰胺盐酸盐中的至少一种；步骤(2)中所述的交联剂为含有多个不饱和双键的化合物，优选为N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。步骤(2)中所述的引发剂为过氧化合物引发剂、偶氮类引发剂和氧化还原引发剂等中的至少一种，优选为过硫酸铵(APS)。步骤(2)所述的催化剂为四甲基乙二胺。步骤(2)中所述的无氧状态下是指通入氮气除氧。步骤(2)中所述的酶、修饰剂、单体、交联剂、引发剂和催化剂的质量比为1：(0.01-0.2)：(1-10)：(0.1-1)：(0.5-1)：(1-2)；步骤(2)中所述的原位自由基聚合反应是指在4～30℃反应1～5h；步骤(2)中所述的纯化是指用截留分子量为1.0～3.5kD的透析袋进行透析纯化。步骤(3)中所述的碳纳米管分散液和酶纳米胶囊溶液的用量满足其中酶纳米胶囊和碳纳米材料的质量比为0.5～3:1；步骤(3)中所述的放入冰箱中静置是指在4℃的冰箱中静置0.5～24h，优选在4℃的冰箱中静置24h；步骤(3)中所述的分离优选为通过离心、过滤、抽滤等方式中的一种进行分离；所述的洗涤是指用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3～5次；一种由上述方法制备得到的双重固定化酶。上述的双重固定化酶在催化方面的应用。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：本专利技术采用原位自由基聚合技术对酶蛋白进行修饰，再通过吸附固定于碳纳米材料之上，与传统吸附固定方法相比，酶纳米胶囊在碳纳米材料上的固载量要远远高于未修饰的酶分子的固载量。本专利技术得到的双重固定化酶保留了高的酶活力，克服了使用游离酶和酶纳米胶囊后，催化剂无法回收的问题，并且得益于酶表面的聚合物层和碳纳米材料之间的协同作用，这种双固定化酶具有比游离酶和传统固定化酶更高的环境稳定性和重复使用性能，酶活性比游离酶的活性更高。附图说明图1为实施例1中不同酶/材料的质量比下的酶固载量和固载率图；图2为实施例1中采用原子力显微镜观察OPH，nOPH，OPH(2)@GO和nOPH(2)@GO的形貌图，其中A～D图依次为OPH，nOPH，OPH(2)@GO和nOPH(2)@GO的表面形貌图；图3为实施例1中OPH，OPH(2)@GO和nOPH(2)@GO在65℃不同孵育时间下的酶活相对值图；图4为实施例4中不同还原程度的氧化石墨烯对OPH(A)和nOPH(B)的固载量和固载率图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。实施例中所述的有机磷水解酶购自于北京森根比亚生物工程技术有限公司；实施例中所述的辣根过氧化物酶(HRP)，葡萄糖氧化酶(GOD)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双重固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将碳纳米材料均匀分散于pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液中，得到碳纳米材料分散液；(2)将酶加入到pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中形成酶溶液，向酶溶液中添加修饰剂，混合均匀并发生酶修饰反应，反应结束后再向其中添加单体、交联剂，然后再在无氧条件下添加引发剂和催化剂，引发原位聚合反应，反应结束后将所得反应液纯化即得到酶纳米胶囊溶液；(3)向步骤(1)中的碳纳米材料分散液中添加步骤(2)制备的酶纳米胶囊溶液，混匀后放入冰箱中静置，最后将混合液分离、洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。

【技术特征摘要】
1.一种双重固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将碳纳米材料均匀分散于pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液中，得到碳纳米材料分散液；(2)将酶加入到pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中形成酶溶液，向酶溶液中添加修饰剂，混合均匀并发生酶修饰反应，反应结束后再向其中添加单体、交联剂，然后再在无氧条件下添加引发剂和催化剂，引发原位聚合反应，反应结束后将所得反应液纯化即得到酶纳米胶囊溶液；(3)向步骤(1)中的碳纳米材料分散液中添加步骤(2)制备的酶纳米胶囊溶液，混匀后放入冰箱中静置，最后将混合液分离、洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。2.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的碳纳米材料为石墨烯，氧化石墨烯，还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纤维、碳纳米球中的一种或几种混合；步骤(1)中所述的分散指采用搅拌或超声中的至少一种方式进行分散，步骤(1)中所述的碳纳米材料分散液的浓度为1～10mg/mL。3.根据权利要求2所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的碳纳米材料为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管中的一种或几种混合；步骤(1)中所述的分散指采用机械搅拌并结合超声处理1～5h进行分散，其中机械搅拌的速度为100～1000r/min，超声功率为100～200W。4.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的酶包括但不限于有机磷水解酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶、漆酶、甲酸脱氢酶，甲醛脱氢酶，甲醇脱氢酶，葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖异构酶、苹果酸酶和丙氨酸脱氢酶；步骤(2)中所述的酶溶液指浓度为1～10mg/mL的酶溶液。5.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的修饰剂为丙烯酸、丙烯酸盐类化合物和丙烯酸酯类...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗志刚，陈永志，
申请(专利权)人：华南协同创新研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44