一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法。本发明专利技术的重组菌是将出发菌进行如下(a1)、(a2)和(a3)的改造得到的：(a1)导入低特异性PHA聚合酶基因；(a2)导入PHB合成途径的关键蛋白的编码基因；(a3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因。本发明专利技术还保护以上任一所述重组菌在制备SCL‑co‑MCL PHA中的应用。本发明专利技术可通过调节碳源比例可控的制备SCL‑co‑MCL PHA，还可通过控制碳源的添加时间来生产Poly(3HB‑co‑MCL 3HA)随机共聚物或嵌段共聚物。本发明专利技术对于生产比例可控的SCL‑co‑MCL PHA具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法。
技术介绍
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是许多微生物天然存在的贮能物质，化学本质是一种高分子聚酯。由于具备完全生物可降解和完全生物合成等特征，PHA被认为是解决全球塑料污染的一类最具潜力的生物材料。经过几十年的生产探索，已有多种PHA被成功合成并投入产业化生产，包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)、聚3-羟基丁酸-4-羟基戊酸酯(P3HB4HB)。由于生产成本过高、材料性能难以满足应用需求，与传统不可降解的石油基塑料相比，PHA的应用仍然面临困境。PHA具有结构多样性，其单体均为R构型，结构通式见式(Ⅰ)。根据侧链R基的不同，PHA可分为短链PHA(SCLPHA)和中长链PHA(MCLPHA)。SCLPHA主要由3C到5C单体构成，通常具有结晶度高、脆性大、延展性差等特征，并具有较高的熔融温度和玻璃态转化温度，大大限制其推广和应用。MCLPHA由6C-14C的单体构成，通常呈现出弹性塑料的低结晶度，高柔韧性等特点，但MCLPHA在实际加工中容易软化，其应用同样受到限制。短链中长链共聚的PHA(SCL-co-MCLPHA)同时含有SCL单体和MCL单体，结合两者的优点，改善SCLPHA或MCLPHA性能的不足，SCL-co-MCLPHA被认为是一种有潜力的PHA材料。目前SCL-co-MCLPHA的研究受限于以下几个方面：(1)低特异性PHA聚合酶(PhaC蛋白，由phaC基因编码)。根据PHA聚合酶的底物特异性，可被分为三类：SCL特异性PHA聚合酶、MCL特异性PHA聚合酶、低特异性PHA聚合酶。目前已知并用于生产的绝大多数PhaC属于前两类，只能特异性聚合SCL单体或MCL单体。仅有少数几种PhaC被发现能够同时聚合SCL和MCL单体，即具有低特异性，且有些是通过突变改造后改善的。(2)合适的底盘菌株。天然微生物一般只能积累SCL或MCL其中一种PHA。(3)MCL单体比例难以控制。除了PHBHHx这种仅含两种单体的聚合物外，常说的SCL-co-MCLPHA实际上由不止两种单体组成。由于大部分菌株的β-氧化循环存在或削弱不彻底，作为底物的脂肪酸进入细胞后每经过一次β-氧化循环就会丢失两个碳原子，因此菌株合成的SCL-co-MCLPHA中的MCL单体部分一般包括C6、C8、C10、C12等多个单体，很少能够合成只由一种SCL单体和一种MCL单体组成的聚合物。由于β-氧化循环产生的中长链单体比例(C6：C8：C10：C12)不容易控制，不同批次得到的SCL-co-MCLPHA可能在MCL单体比例上差别较大，材料性能难以得到稳定保证。
技术实现思路
针对现有技术中短链中长链共聚的聚羟基脂肪酸酯(SCL-co-MCLPHA)的困难，本专利技术的专利技术人经过反复的研究和实验验证，专利技术了一种微生物生产SCL-co-MCLPHA的方法。本专利技术保护一种重组菌，是将出发菌进行如下(a1)、(a2)和(a3)的改造得到的：(a1)导入低特异性聚羟基脂肪酸酯(PHA)聚合酶基因；(a2)导入聚3-羟基丁酸酯(PHB)合成途径的关键蛋白的编码基因；(a3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因。本专利技术还保护一种重组菌，是将出发菌进行如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)和(b5)的改造得到的：(b1)导入低特异性PHA聚合酶基因；(b2)导入PHB合成途径的关键蛋白的编码基因；(b3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因；(b4)敲除内源的β-氧化循环相关基因；(b5)敲除內源的PHA聚合酶基因。以上任一所述低特异性PHA聚合酶能够聚合短链和中长链的PHA单体(比如3-羟基丁酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸等)。以上任一所述低特异性PHA聚合酶包括但不限于经过饱和突变的低特异性PHA聚合酶PhaC61-3(由phaC61-3编码)。以上任一所述PHB合成途径的关键蛋白包括但不限于β-酮基硫解酶(PhaA蛋白,由phaA编码)和NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶(PhaB蛋白，由phaB编码)。以上任一所述β-酮基硫解酶包括但不限于来源于RalstoniaeutrophaH16的β-酮基硫解酶。以上任一所述NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶包括但不限于来源于RalstoniaeutrophaH16的NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶。导入低特异性PHA聚合酶基因和导入PHB合成途径的关键蛋白的编码基因具体可通过导入特异DNA分子甲实现。所述特异DNA分子中具有启动子、低特异性PHA聚合酶基因、β-酮基硫解酶基因和NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶基因；由所述启动子启动低特异性PHA聚合酶基因、β-酮基硫解酶基因和NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶基因的表达。导入低特异性PHA聚合酶基因和导入PHB合成途径的关键蛋白的编码基因具体可通过导入特异质粒甲实现。所述特异质粒甲为具有所述特异DNA分子甲的质粒。所述特异质粒甲具体可如序列表的序列1所示。以上任一所述脂肪酸从头合成途径关键酶包括但不限于(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶(PhaG蛋白，由phaG编码)。敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因具体可通过导入特异DNA分子乙实现。所述特异DNA分子乙中具有对应于(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶基因上游的同源臂和对应于(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶基因下游的同源臂。敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因具体可通过导入特异质粒乙实现。所述特异质粒乙为具有所述特异DNA分子乙的质粒。所述特异质粒乙具体可如序列表的序列2所示。所述低特异性PHA聚合酶(PhaC61-3蛋白)的一种具体形式如序列表的序列4所示。但不限于该具体形式。所述β-酮基硫解酶(PhaA蛋白)的一种具体形式如序列表的序列5所示。但不限于该具体形式。所述NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶(PhaB蛋白)的一种具体形式如序列表的序列6所示。但不限于该具体形式。所述(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶(PhaG蛋白)的一种具体形式如序列表的序列7所示。但不限于该具体形式。所述低特异性PHA聚合酶基因(phaC61-3基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第464-2143位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述β-酮基硫解酶基因(phaA基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第2228-3409位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶基因(phaB基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第3484-4224位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶基因(phaG基因)的一种具体形式如序列表的序列3中第808-1692位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述启动子包括但不限于Pre启动子。所述Pre启动子如序列表的序列1中第33-428位核苷酸所示。以上任一所述出发菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌，是将出发菌进行如下(a1)、(a2)和(a3)的改造得到的：(a1)导入低特异性聚羟基脂肪酸酯聚合酶基因；(a2)导入聚3‑羟基丁酸酯合成途径的关键蛋白的编码基因；(a3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因；所述出发菌为假单胞菌或嗜盐单胞菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，是将出发菌进行如下(a1)、(a2)和(a3)的改造得到的：(a1)导入低特异性聚羟基脂肪酸酯聚合酶基因；(a2)导入聚3-羟基丁酸酯合成途径的关键蛋白的编码基因；(a3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因；所述出发菌为假单胞菌或嗜盐单胞菌。2.一种重组菌，是将出发菌进行如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)和(b5)的改造得到的：(b1)导入低特异性聚羟基脂肪酸酯聚合酶基因；(b2)导入聚3-羟基丁酸酯合成途径的关键蛋白的编码基因；(b3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因；(b4)敲除内源的β-氧化循环相关基因；(b5)敲除內源的聚羟基脂肪酸酯聚合酶基因；所述出发菌为假单胞菌或嗜盐单胞菌。3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述聚3-羟基丁酸酯合成途径的关键蛋白包括但不限于β-酮基硫解酶和NADPH/NADH依赖型乙酰辅酶A还原酶；所述脂肪酸从头合成途径关键酶包括但不限于(R)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶。4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述低特异性聚羟基脂肪酸酯聚合酶包括但不限于序列表的序列4所示；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，李梦怡，陈祥斌，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11