高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用技术

技术编号:20216893 阅读:63 留言:0更新日期:2019-01-28 17:17
本发明专利技术公开了高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。所述大肠杆菌重组菌含有如下一种或多种遗传修饰:(1)脂肪酸摄入途径及脂肪酸β氧化途径的增强;(2)改造了乙醛酸循环相关基因靶点,增强了乙醛酸的合成能力;(3)引入/增强谷氨酸乙醛酸转氨酶基因的表达。本发明专利技术的工程菌株具有将不同长度脂肪酸底物全细胞转化合成甘氨酸的能力,所述脂肪酸可为硬脂酸(C18)、棕榈酸(C16)、肉豆蔻酸(C14)、月桂酸(C12)、癸酸(C10)、辛酸(C8)或己酸(C6)。所述工程菌株的利用脂肪酸合成甘氨酸的能力使其具有工业生产甘氨酸产品的用途。

【技术实现步骤摘要】
高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及工业微生物的生物技术以及生物化工领域,具体涉及高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。
技术介绍
随着社会的发展,人类面临着能源短缺、资源紧张、环境恶化、经济衰退和气候变化等一系列严峻的挑战,生物制造、生物能源等新型产业正在兴起。生物技术较传统的化学品生产具有节能、减排、降耗的优势。通过对工业微生物菌株进行遗传改造,可以增强微生物细胞对原料的利用、提高产品转化率,从而降低生产成本。甘氨酸(英文名为Glycine)又名氨基乙酸,是结构最简单的α-氨基酸。它是一种非常重要的精细化工合成中间体,在医药、食品、农药以及饲料添加剂等领域都广泛应用。(1)在生物体内,甘氨酸是一些重要的小分子代谢物的合成前体,在饮食中加入适量的甘氨酸可以有效的治疗心血管疾病、炎症、肥胖、肿瘤以及糖尿病病人的代谢紊乱。(2)甘氨酸是盐酸地拉普利、草甘氨酸阿司匹林钙、扑热息痛甘氨酸盐、以及利血胺注射液等多种药物合成的中间体。(3)甘氨酸作为氨基酸强化剂、调味剂、甜味剂以及抗氧化剂广泛应用于食品行业。(4)甘氨酸是合成除草剂草甘膦的前体物质,该除草剂曾被美国政府评为最优秀的农药。目前合成甘氨酸的方法主要有氯乙酸氨解法、施特雷克法(Strecker)、催化脱氢氧化法、辐射合成法和生物合成法等。其中的生物合成法,在此之前有利用乙醇胺为底物,在好氧土壤杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属等微生物的作用下转化获得,也有利用假细胞菌属、酪蛋白菌属、产碱杆菌属等菌属将甘氨酰胺水解生成甘氨酸。虽然以上方法可以实现甘氨酸的生产,但是存在原料成本较高以及酶活较低,需要大量菌株的问题,使得生物转化仍需要建立一种更为廉价的原料路线。脂肪酸是一类具有高度还原状态的物质,经过β氧化生成大量的二碳物质乙酰辅酶A,然后通过乙醛酸循环得到乙醛酸最后生成甘氨酸,以脂肪酸(棕榈酸)为底物生成甘氨酸,其理论转化率能高达234.21%,显著高于葡萄糖,并且用于生物转化的脂肪酸原料可以以低廉的价格从油料粗加工产物、地沟油等来源获得,因此以脂肪酸为底物生产甘氨酸具有巨大的潜力。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何提高甘氨酸的合成效率。为了解决上述技术问题,本专利技术通过增强脂肪酸摄入途径及脂肪酸β氧化途径提高了脂肪酸底物的利用能力,又通过改造初级代谢加强中间产物乙醛酸的积累、引入/增强甘氨酸合成途径所需的谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因的表达提高了甘氨酸的合成能力,同时改进了NADPH、谷氨酸等辅助因子的供应进一步提高了甘氨酸的合成效率。提供了一种高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌。第一方面,本专利技术保护高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术提供的高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌的构建方法包括对受体菌进行(1)-(13)的改造或对受体菌进行(1)-(7)的改造,得到重组大肠杆菌的步骤;(1)抑制所述受体菌中fadR基因的表达或/和抑制所述受体菌中fadR基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的活性;(2)增强所述受体菌中sthA基因的表达或/和增强所述受体菌中sthA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的活性;(3)抑制所述受体菌中pntA基因的表达或/和抑制所述受体菌中pntA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的活性;(4)增强所述受体菌中fadL基因的表达或/和增强所述受体菌中fadL基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的活性;(5)增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(6)增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(7)增强所述受体菌中外源alkL基因的表达或/和增强所述受体菌中外源alkL基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的活性;(8)抑制所述受体菌中iclR基因的表达或/和抑制所述受体菌中iclR基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的活性;(9)抑制所述受体菌中aceB基因的表达或/和抑制所述受体菌中aceB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶A的活性;(10)抑制所述受体菌中glcB基因的表达或/和抑制所述受体菌中glcB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶G的活性;(11)增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因的表达或/和增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的活性;(12)增强所述受体菌中外源cgaT基因的表达或/和增强所述受体菌中外源cgaT基因所编码蛋白质即谷氨酸乙醛酸转氨酶II的活性;(13)增强所述受体菌中gdhA基因的表达或/和增强所述受体菌中gdhA基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的活性。上述方法中,fadR基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的氨基酸序列的GenBank:NP_415705.1(提交日期为2016年8月8日)。sthA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的氨基酸序列的GenBank:NP_418396.1(提交日期为2016年8月8日)。pntA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的氨基酸序列的GenBank:NP_416120.1(提交日期为2016年8月8日)。fadL基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的氨基酸序列的GenBank:NP_416846.2(提交日期为2016年8月8日)。外源alkL基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的氨基酸序列的GenBank:CCG96306.1(提交日期2015年2月27日)。iclR基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的氨基酸序列的GenBank:NP_418442.2(提交日期为2016年8月8日)。aceB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶A的氨基酸序列的GenBank:NP_418438.1(提交日期为2016年8月8日)。glcB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶G的氨基酸序列的GenBank:NP_417450.1(提交日期为2016年8月8日)。aceA基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的氨基酸序列的GenBank:NP_418439.1(提交日期为2016年8月8日)。gdhA基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列的GenBank:NP_416275.1(提交日期为2016年8月8日)。上述方法中,所述(5)中,所述脂肪酸β氧化途径所涉及的基因选自如下一种或多种基因:编码脂酰辅酶A合酶的基因fadD、编码脂酰辅酶A脱氢酶的基因fadE、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的基因fadB、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的基因fadA、编码3-酮脂酰辅酶A硫解酶的基因fadI、编码3-羟酰辅酶A脱氢酶的基因fadJ和编码短链脂酰辅酶A合酶的基因fadK。在本专利技术的一个实施例中,所述脂肪酸β氧化途径所涉及的基因具体为编码脂酰辅酶A合酶的基因fadD。上述方法中,所述(6)中,所述短链脂肪酸降解途径所涉及的基因选自如下基因簇所包含的基因:短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC、短链脂肪酸降解基因簇atoDAEB。其中,所述短链脂肪酸降解调控基因簇atoSC包含本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌的构建方法,包括对受体菌进行(1)‑(13)的改造或对受体菌进行(1)‑(7)的改造,得到重组大肠杆菌的步骤;(1)抑制所述受体菌中fadR基因的表达或/和抑制所述受体菌中fadR基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的活性;(2)增强所述受体菌中sthA基因的表达或/和增强所述受体菌中sthA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的活性;(3)抑制所述受体菌中pntA基因的表达或/和抑制所述受体菌中pntA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的活性;(4)增强所述受体菌中fadL基因的表达或/和增强所述受体菌中fadL基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的活性;(5)增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(6)增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(7)增强所述受体菌中外源alkL基因的表达或/和增强所述受体菌中外源alkL基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的活性;(8)抑制所述受体菌中iclR基因的表达或/和抑制所述受体菌中iclR基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的活性;(9)抑制所述受体菌中aceB基因的表达或/和抑制所述受体菌中aceB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶A的活性;(10)抑制所述受体菌中glcB基因的表达或/和抑制所述受体菌中glcB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶G的活性;(11)增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因的表达或/和增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的活性;(12)增强所述受体菌中外源cgaT基因的表达或/和增强所述受体菌中外源cgaT基因所编码蛋白质即谷氨酸乙醛酸转氨酶II的活性;(13)增强所述受体菌中gdhA基因的表达或/和增强所述受体菌中gdhA基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的活性。...

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌的构建方法,包括对受体菌进行(1)-(13)的改造或对受体菌进行(1)-(7)的改造,得到重组大肠杆菌的步骤;(1)抑制所述受体菌中fadR基因的表达或/和抑制所述受体菌中fadR基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的活性;(2)增强所述受体菌中sthA基因的表达或/和增强所述受体菌中sthA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的活性;(3)抑制所述受体菌中pntA基因的表达或/和抑制所述受体菌中pntA基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的活性;(4)增强所述受体菌中fadL基因的表达或/和增强所述受体菌中fadL基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的活性;(5)增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(6)增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性;(7)增强所述受体菌中外源alkL基因的表达或/和增强所述受体菌中外源alkL基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的活性;(8)抑制所述受体菌中iclR基因的表达或/和抑制所述受体菌中iclR基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的活性;(9)抑制所述受体菌中aceB基因的表达或/和抑制所述受体菌中aceB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶A的活性;(10)抑制所述受体菌中glcB基因的表达或/和抑制所述受体菌中glcB基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶G的活性;(11)增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因的表达或/和增强所述受体菌中乙醛酸途径aceA基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的活性;(12)增强所述受体菌中外源cgaT基因的表达或/和增强所述受体菌中外源cgaT基因所编码蛋白质即谷氨酸乙醛酸转氨酶II的活性;(13)增强所述受体菌中gdhA基因的表达或/和增强所述受体菌中gdhA基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的活性。2.根据权利要求1的方法,其特征在于:所述脂肪酸β氧化途径所涉及的基因选自如下一种或多种基因:编码脂酰辅酶A合酶的基因fadD、编码脂酰辅酶A脱氢酶的基因fadE、编码3...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘伟丰向书漫刘波陶勇
申请(专利权)人:中国科学院微生物研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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