一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用，属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫。其中胶体金垫内有胶体金标记的抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。本发明专利技术建立的胶体金免疫层析试纸条具有方便、快速、灵敏和特异等优点，可用于感染ASFV细胞直接检测，适合ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

A Colloidal Gold Immunochromatographic Test Paper for Detecting African Swine Fever Virus Antigen and Its Preparation Method and Application*

The invention relates to a colloidal gold immunochromatographic test paper for detecting African swine fever virus antigen, a preparation method and application, belonging to the field of virus epidemic diagnosis technology and animal quarantine, including a PVC substrate, which is sequentially fixed with sample pads, colloidal gold pads, nitrocellulose membranes and water absorbent pads.* Mab1, a monoclonal antibody against one epitope of ASFV P30 antigen labeled with colloidal gold in the colloidal gold pad, and Mab2, a monoclonal antibody against another epitope of ASFV P30 antigen, were marked on the surface of cellulose nitrate membrane, and the quality control line was sheep anti-mouse IgG antibody. The colloidal gold immunochromatographic strip has the advantages of convenience, rapidity, sensitivity and specificity, and can be used for direct detection of ASFV*infected cells, and is suitable for ASFV infection diagnosis, epidemiological investigation and international trade quarantine inspection of live pigs.

【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用
本专利技术属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用。
技术介绍
非洲猪瘟(ASF)是猪的一种高度接触性传染病，高致病性的ASFV感染家猪后死亡率可达100％，该病一直在许多非洲国家流行，目前已传播到格鲁齐亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，对我国养猪业的威胁十分巨大。由于目前无疫苗用于ASF防疫，因此快速、准确的诊断对防止该病的传播、流行十分重要。世界动物卫生组织(OIE)推荐的ASF诊断技术包括病原检测、核酸鉴定和血清学试验。在病原检测常用的技术中，血吸附试验是经典的ASF诊断方法之一，敏感性较高，但需要临时制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时、操作繁琐，而且不能用于非血吸附性毒株的诊断；检测ASFV抗原的荧光抗体试验可用于可疑病猪组织和白细胞样品的检测，不仅适用于非血吸附性毒株的鉴定，而且能与其它病毒感染进行鉴别诊断，但需要制备冰冻切片或涂片，技术难度较大，而且只能在专门的ASF诊断参考实验室进行。ASFV核酸鉴定常用的方法为聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR，这些方法具有快速、灵敏等优点，还适合腐败样品的病毒检测，已成为主要的ASF诊断技术，但需要较昂贵的仪器设备和防污染措施，有时检测结果需用序列测定等方法验证。在血清学检测技术中，ASFV感染猪在感染后7-10天即可产生特异抗体，并能维持很长时间，所以可用间接免疫荧光和酶联免疫吸附法(ELISA)等方法检测。其中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法，但检测抗原需从病毒感染细胞制备，病毒培养有导致病毒扩散风险，诊断可靠性也有待提高，结果需用免疫印迹(Western-blotting)等方法验证。为了解决这些问题，国内外都在进行重组抗原ELISA的尝试，法国和西班牙已有商品化试剂盒供应，但因重组抗原制备难度较大，不仅试剂盒供应有限、价格昂贵，而且不同地区病毒株的检测结果有待进一步验证。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术提供一种准确率高、检测效率高的检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用。申请人研发出针对ASFV抗体的多抗原间接ELISA试剂盒和胶体金试纸，经验证具有较高的检测准确率。ASFVp30是由ASFVORFCP204L编码的一大小为30kD的蛋白，在病毒感染早期，胞浆内大量表达的p30氨基末端丝氨酸残基发生磷酸化后，被包装进病毒粒子；p30抗原性极好，可诱导机体产生强烈的体液免疫应答，激发动物机体产生具有一定中和作用的抗体。根据p30在细胞胞浆内表达早、表达量大的特点，本专利技术用制备的两株针对p30不同表位的单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA胶体金免疫层析试纸，检测细胞内p30，从而确诊动物是否感染ASFV。该胶体金免疫层析试纸可在短时间内获得明确的诊断结果，并能用于猪外周血单核细胞、ASFV体外感染细胞内p30抗原的检测，特别适合ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：抗ASFVp30单克隆抗体Mab1，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFVp30单克隆抗体Mab1针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。抗ASFVp30单克隆抗体Mab2，分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFVp30单克隆抗体Mab2针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。本专利技术要求分别保护单克隆抗体Mab1和Mab2及其组合。本专利技术提供一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中胶体金垫内有胶体金标记抗ASFVp30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。胶体金标记抗ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab1，具体为：用直径40nm的胶体金标记Mab1，标记时pH8.0，Mab1标记浓度为10μg/mL；离心沉淀胶体金标记物，用pH8.5的复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液由10％蔗糖，1％PVP，1％BSA，0.5％Tween-20，0.1MTrisCl组成，复溶液浓缩比例为125μL/mL，最终胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。检测线的ab2工作浓度为1.6mg/mL，质控线的抗鼠IgG抗体工作浓度为1.5mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为0.5cm。一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：1)SFVp30抗原单克隆抗体的制备、表位区域及抗体亚类鉴定；2)检测ASFVp30抗原胶体金免疫层析试纸制备。步骤2)具体为：标记p30单克隆抗体Mab1的胶体金垫制备；硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂；试纸条组装。检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸在制备ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验的试剂中的应用。具体地，一种检测ASFV抗原胶体金免疫层析试纸制备方法包括以下步骤：1.抗ASFVp30抗原单克隆抗体的制备、表位区域及抗体亚类鉴定(1)p30重组抗原的制备人工合成密码子优化了的ASFVp30基因catatgGACTTCATCCTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中胶体金垫内有胶体金标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中胶体金垫内有胶体金标记抗ASFVp30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。3.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：胶体金标记抗ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab1，具体为：用直径40nm的胶体金标记Mab1，标记时pH8.0，Mab1标记浓度为10μg/mL；离心沉淀胶体金标记物，用pH8.5的复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液由10%蔗糖，1%PVP，1%BSA，0.5%Tween-20，0.1MTrisCl组成，复溶液浓缩比例为125μL/mL，最终胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。4.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：检测线的ab2工作浓度为1.6mg/mL，质控线的抗鼠IgG抗体工作浓度为1.5mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为0.5cm。5.根据权利要求1-4任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫宇，刘潇羽，孙怀昌，周花艳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32