生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法及应用，利用联乙炔单体和磷脂分子制备具有力致变色特征的脂质体，将该脂质体修饰在能够特异性识别待测标志物的抗体、凝集素或多肽分子等探针分子表面，探针分子与目标待测标志物反应，导致该脂质体发生力致变色，得到将探针分子对待测生物标志物的识别信号，转换成肉眼可见的可见光色谱的标记方法，根据溶液发生的颜色变化进行定性判断。本发明专利技术方法及标记物在可见光范围发生明显的颜色变化，所需成分更少，所耗成本更低，反应过程更快。

The Marking Method and Application of Biomarker Recognition Signal Converted to Visible Chromatography

The invention discloses a labeling method and application for converting the recognition signal of biomarkers into visible light chromatography. Liposomes with force-induced chromogenic characteristics are prepared by using acetylene monomer and phospholipid molecule. The liposome is modified on the surface of probe molecules such as antibodies, lectins or polypeptide molecules that can specifically recognize the biomarkers to be detected, and the probe molecule reacts with the target marker to be detected. Therefore, the liposomes can be dynamically discolored, and the recognition signal of the probe molecule to the detected biomarkers can be obtained, which can be transformed into a naked eye visible light chromatographic marking method, and the qualitative judgment can be made according to the color change of the solution. The method and the marker of the invention have obvious color change in the visible light range, less components required, lower cost and faster reaction process.

【技术实现步骤摘要】
生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法及应用
本专利技术属于生物医学、临床检验医学及快速检测
，涉及一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法及应用。
技术介绍
随着老龄化社会到来，骨科疾病对人体的危害程度日显突出，对相关疾病早期诊断、进程掌握的要求也越来越高。病理上对人体骨骼代谢及相关疾病认识清晰，针对骨的生理状态(骨形成与吸收)综合评估是判断骨发育、骨衰减以及骨流失，从而对骨疾病进行诊断分析的基础。其中I型胶原是骨结构中最主要的成分之一，在骨组织中骨基质代谢中，I型胶原被降解，生成的分子片段被释放在血液或尿液中，这些小片段能够有效的反应骨形成与吸收。反映骨形成的标志物片段有I型原胶原羧基端前肽(PICP)，反映骨吸收的标志物片段有I型胶原吡啶交联终肽(ICTP)与I型胶原羧基端肽(CTX)等等，同时其它类型胶原降解生成的尿吡啶醚(PYD)和脱氧吡啶醚(DPD)也是反映骨吸收的重要指标。因此快速检测血清、尿液中I型胶原的上述分子片段是骨疾病分析诊断的主要方法，也是快速诊断的基础。在诸多针对I型胶原及其分子片段的检测方法中，基于免疫学分析检测方法是综合评估的重要方法。免疫标记技术(IA)是指在已知抗原或抗体上标记某种易于检测的物质，通过将抗原与抗体的特异性结合，转换成其它信号，检测某些分子的存在与否或浓度大小。由于这一技术使用的标记物种类多样，其中许多产物制备简单，成本低廉，因此它在多种不同的应用领域中具有极大的应用价值。并且不同的标记物转换出的信号也不同，根据标记物不同可将免疫标记技术分为，放射免疫标记技术、酶联免疫标记技术、化学发光免疫标记技术、荧光免疫标记技术以及胶体金免疫标记技术等。这些标记方法共同的问题是不适用于快速检测和半定量分析，特别不适于老龄化社会的社区医院及家庭养老。下面例举已有标记技术存在着的不足之处：(1)放射免疫标记技术：存在微弱的放射性污染，废料处理难度大；放射性同位素半衰期的存在增大了实验操作难度；(2)酶联免疫标记技术：酶标记物容易失活；灵敏度不高；反应过程相对复杂；(3)荧光免疫标记技术：反应过程迅速，但同时易受到光散射以及样品内源性荧光物质的影响；(4)发光免疫标记技术：需要额外的固相载体，操作过程相对复杂；(5)胶体金免疫标记技术：灵敏度受影响，技术要高，操作过程困难。综上所述，针对目前因为标记带来的不利于基层医院及家庭快速诊断方法，该专利技术基于免疫分析，设计一种新型标记方法，对尿液、血清中I型胶原分子片段的快速诊断、床前诊断(POCT)，对小孩、老人尤为重要。对比用各种不同标记与分析方法，采用了一种基于力致变色技术，成为可见光颜色信号的转换方式，并制备成颜色谱图或比色板，适用于对家庭育儿与养老及其它需要简单、快速而又科学判断的地方。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种新的免疫标记方法，利用力致变色技术，将抗体抗原间特异性结合力转换成为肉眼可见的光信号。这种可见关光信号以颜色变化为特征，从而设计出一种适用于快速检测I型胶原的新型免疫分析技术。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种适用于现场快速检测的免疫标记方法，包括：利用联乙炔结构单体和磷脂分子聚集体，制备具有力致变色为可见光信号脂质体；将该脂质体与能够特异性识别待测物的抗体、凝集素或多肽分子修饰在脂质体表面得到生物标记物；目标待测物与生物标记物反应，根据溶液发生的颜色变化进行定性判断。所述的联乙炔结构单体选自10,12-二十五碳二炔酸、10,12-二十三碳二炔酸、10,12-二十五二炔-1-醇、2,4-十五碳二炔酸、2,4-十九碳二炔酸、2,4-十七碳二炔酸、10,12-二十七碳二炔酸、10,12-二十五烷二炔酸甲酯、10,12-二十九碳二炔酸、5,7-十六碳二炔酸中之一种。所述的脂质体通过将联乙炔结构单体的一种或多种溶解于溶剂中，或者将单体与磷脂分子混合后溶解，制备出不同尺寸及形态的脂质体。优选的，所述的脂质体的具体制备过程为在溶剂中将联乙炔结构单体与不同联乙炔结构单体或磷脂分子混合，配置成溶液并除去溶剂，再加入缓冲液并保持浓度，将该分散液在一定条件下超声震荡后保存。其中，所述的缓冲溶液选自磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、硼酸盐、巴比妥酸、三羟甲基氨基甲烷碱或醋酸盐缓冲液中的任意一种。优选的，通过膜过滤的方式，分离所述尺寸形态不同的脂质体，留下尺寸在30～250nm间的光滑球状结构的脂质体。优选的，所述的脂质体采用注入法或旋转薄膜超声法或氮吹成膜超声法的方法制备。优选的，针对联乙炔结构单体组装的聚集体，所述的修饰手段选自嵌入、吸附或偶联。其中化学偶联的交联剂选自碳二亚胺、戊二醛、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中之一种。优选的，针对联乙炔结构单体与磷脂分子混合制备的聚集体，所述的修饰手段为将探针分子(配体)嵌入在磷脂分子中得到。利用本专利技术方法将不同浓度的抗体装配在脂质体表面，用得到的抗体/脂质体生物标记物检测识别不同浓度的目标物，根据颜色渐变绘制出颜色谱图或比色板。在本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种生物标记物，所述的生物标记物通过将能够特异性识别待测物的抗体、凝集素或多肽分子装配在联乙炔结构单体和磷脂分子聚集体的表面得到。在本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种用于标记I型胶原及其相关分子片段的生物标记物，通过联乙炔结构单体与磷脂分子混合制备聚集体，将探针分子嵌入在磷脂分子中得到。其中，所述的探针分子为I型胶原单克隆抗体、I型原胶原羧基端前肽(PICP)单克隆抗体、I型胶原吡啶交联终肽(ICTP)单克隆抗体、I型胶原羧基端肽(CTX)单克隆抗体、尿吡啶醚(PYD)单克隆抗体或脱氧吡啶醚(DPD)单克隆抗体。所述的I型胶原相关分子片段为I型原胶原羧基端前肽(PICP)，I型胶原吡啶交联终肽(ICTP)、I型胶原羧基端肽(CTX)、尿吡啶醚(PYD)或脱氧吡啶醚(DPD)等。在本专利技术的另一方面，一种用于快速检测I型胶原及其相关分子片段的免疫标记方法，将含一定量的I型胶原或相关分子片段的待测血清或尿液样品加入上述生物标记物中，恒温孵育一段时间，观察颜色变化，对照比色板，快速得到目标物浓度大小。在本专利技术的另一方面，上述生物标记物作物检测I型胶原及其相关分子片段在纳米传感器中的应用。在本专利技术的另一方面，也可以提供一种基于荧光信号转换的新型免疫标记技术。所述基于荧光信号转换的新型免疫标记技术的使用方法包括：将含一定量的I型胶原分子或相关分子片段的待测血清或尿液样品加入上述生物标记工具中，恒温孵育一段时间，观察混合液颜色变化，该颜色变化受到样品中胶原分子或小分子片段浓度大小的影响，脂质体荧光信号出现转变，利用共聚焦显微镜进行半定量分析。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供一种区别于传统免疫标记技术的新型标记方法，针对当前传统免疫标记技术存在的缺陷，依据免疫识别技术，以及由共轭聚合物在可见光范围内发生力致变色的机理等，建立一种区别于传统免疫标记技术的新型标记手段。本专利技术具有操作简单，反应迅速，稳定性高，信号易识别的特点，是一种比传统生物标记方法更加高效，更易普及，成本更低廉的新型标记技术。本专利技术利用抗体、凝集素或多肽分子对对应目标物的特异性识别以及分子聚集体在可见光范围发生力致变色的机理，将该识别信号转变为能够肉眼识别的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法，其特征在于，包括：利用联乙炔单体和磷脂分子，制备具有力致变色为可见光信号脂质体；将该脂质体修饰或标记在与能够特异性识别待测生物标志物的抗体、凝集素或多肽等探针分子表面，得到生物传感器；目标待测生物标志物与探针分子特异性反应，导致该脂质体发生力致变色，根据溶液发生的颜色变化进行定性判断。

【技术特征摘要】
1.一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法，其特征在于，包括：利用联乙炔单体和磷脂分子，制备具有力致变色为可见光信号脂质体；将该脂质体修饰或标记在与能够特异性识别待测生物标志物的抗体、凝集素或多肽等探针分子表面，得到生物传感器；目标待测生物标志物与探针分子特异性反应，导致该脂质体发生力致变色，根据溶液发生的颜色变化进行定性判断。2.根据权利要求1所述的一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法，其特征在于，所述的联乙炔结构单体选自10,12-二十五碳二炔酸、10,12-二十三碳二炔酸、10,12-二十五二炔-1-醇、2,4-十五碳二炔酸、2,4-十九碳二炔酸、2,4-十七碳二炔酸、10,12-二十七碳二炔酸、10,12-二十五烷二炔酸甲酯、10,12-二十九碳二炔酸、5,7-十六碳二炔酸中之一种。3.根据权利要求1所述的一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法，其特征在于，所述的脂质体通过将联乙炔结构单体的一种或多种溶解于溶剂中，或者将单体与磷脂分子混合后溶解，制备得到脂质体。4.根据权利要求3所述的一种对生物标志物的识别信号转换成可见光色谱的标记方法，其特征在于，针对联乙炔结构单体组装的聚集体，所述的修饰手段为嵌入、吸附或偶联。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋波，邓啸鸣，冯欢欢，李晓磊，李霞，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51