一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术属于养殖技术领域，尤其是一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)在MEM基础培养基中加入新生牛血清、中药提取液配制成培养液；(2)使用培养液对Marc‑145细胞进行驯化培养，得到Marc‑145细胞培养液；(3)将猪蓝耳病毒液解入到Marc‑145细胞培养液培养得到病毒液；(4)将病毒液进行澄清、分离、浓缩、纯化；(5)将纯化的病毒液灭活后，与中药提取液配置成灭活疫苗。本发明专利技术所使用的中药提取液由茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿制成，能提T细胞、B细胞等细胞因子的活性，促进机体产生抗体。因此，本发明专利技术使用中药提取液驯化培养Marc‑145细胞、配置灭活疫苗，能有效提高灭活疫苗对免疫系统的刺激性。

Preparation of an inactivated vaccine against porcine blue ear disease

The invention belongs to the field of aquaculture technology, in particular to a preparation method of an inactivated vaccine for pig blue ear disease, which comprises the following steps: (1) adding new bovine serum and traditional Chinese medicine extracts into the MEM basal medium to prepare the culture medium; (2) using the culture medium to Domestication and culture the Marc 145 cells, and obtain the Marc 145 145 cell culture medium; (3) the swine blue ear virus solution is dissolved into the culture of Marc 145 cells. The virus liquid was obtained by liquid culture; (4) the virus liquid was clarified, separated, concentrated and purified; (5) after inactivating the purified virus liquid, the inactivated vaccine was prepared with the extract of traditional Chinese medicine. The traditional Chinese medicine extract used in the invention is made of Poria cocos, dandelion, astragalus, argyi grass, corn silk, dodder, Atractylodes macrocephala, Acanthopanax senticosus and epimedium, which can activate T cells, B cells and other cytokines, and promote the body to produce antibodies. Therefore, the invention domesticates and cultures Marc 145 cells with Chinese medicine extract and disposes inactivated vaccine, which can effectively improve the stimulation of inactivated vaccine to the immune system.

【技术实现步骤摘要】
一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法
本专利技术属于养殖
，尤其是一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
猪蓝耳病(PRRS)，又称为神秘猪病、新猪病、猪流行性流产和呼吸综合症、猪生殖与呼吸综合症、蓝耳病、猪瘟疫等，是我国猪病中最主要的一种免疫抑制病，主要引起怀孕母猪后期流产、早产、产死胎和木乃伊胎增多，仔猪出现呼吸道症状和断奶前死亡率增高以及成年猪的免疫机障碍。猪蓝耳病病毒(PRRSV)属于套式病毒目、动脉炎病毒科，呈卵圆形，有囊膜，基因组为单股正链RNA病毒；该病毒的主要靶细胞是单核细胞-巨噬细胞系统，目前普遍认为该病毒的初级复制部位是鼻黏膜或上呼吸道系统中的巨噬细胞，然后通过血液循环扩散至其他器官，并在其中的单核巨噬细胞系统内增殖。猪蓝耳病是一种高度接触性传染病，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感染。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源，主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。目前，猪蓝耳病的主要防治手段是是接种疫苗，但是在实践过程中，蓝耳病疫苗防治经常会出现免疫失败，其主要原因是疫苗免疫时，机体产生中和抗体时间较长，或不能产生高效价的抗体，而在此期间均有可能感染猪蓝耳病毒。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，具体是通过以下技术方案实现的：一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)培养液的配制：在MEM基础培养基中加入新生牛血清、中药提取液配制成培养液A和培养液B；(2)细胞培养：将Marc-145细胞复苏后，接入到培养液A中进行培养，待Marc-145细胞长成单层后；从单层细胞中选择无污染、形态正常的Marc-145细胞接入到培养液B中继续培养，待细胞长到培养液表面的75％～80％时，即得Marc-145细胞培养液；(3)病毒培养：将猪蓝耳病毒液接入到Marc-145细胞培养液中，继续培养至85％以上细胞出现CPE后，收获培养病毒液；(4)纯化：将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓80-100倍后，采用分子筛层析柱对滤液进行纯化；(5)灭活：采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后，加入5％左右的中药提取液混合配置成灭活疫苗。优选地，所述的培养液A是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和15-20％的中药提取液。优选地，所述的培养液B是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和35-45％的中药提取液。优选地，所述的中药提取液按重量份计由10-15份茯苓、6-10份蒲公英、6-10份黄芪、3-5份艾草、10-15份玉米须、3-5份菟丝子、2-4份白术、2-4份刺五加、2-4份淫羊藿。优选地，所述的中药提取液的制备：按重量份配比分别称取茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿，并分别粉碎，然后混合制成药粉；向药粉中加入8倍水浸泡20-30min后,加热煎煮1-1.5h，过滤，得到滤液A和药渣；向药渣中加入5倍80％乙醇，加热到60-70℃，保持恒温30-40min，过滤，回收乙醇，得到滤液B；将滤液A和滤液B混合后，使用孔径为0.5-10μm的微孔滤膜过滤，灭菌，即得中药提取液。优选地，所述的猪蓝耳病毒液的制备：将患有猪蓝耳病的1月龄仔猪剖检，采集肺脏及血清，匀浆研磨后用MEM基础培养基配置成悬浮液，加双抗处理，1500rmp离心20min，取上清液经0.20μm的微孔滤膜除菌，即得猪蓝耳病毒液。优选地，所述的步骤(2)，培养温度为36-37℃。优选地，所述的Marc-145细胞培养液的细胞密度为6×105/ml～8×105/ml优选地，所述的步骤(3)，猪蓝病毒液的接入量为Marc-145细胞培养液体积的1-1.5％。本专利技术的有益效果在于：由茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿制备的中药提取液能促进T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞等细胞因子的产生，提高细胞因子的活性，促进抗体的产生；使用含有中药提取液的培养基对Marc-145细胞进行驯化培养，Marc-145细胞在生长过程中能吸收中药提取液中的成分，再使用驯化后的Marc-145细胞培养猪蓝耳病毒，猪蓝耳病毒也能从其中吸收部分中药成分，从而具有促进抗体生产的能力；使用中药提取液与灭活后的猪蓝耳病毒液配制灭活疫苗，进一步提升了灭活疫苗对细胞因子的刺激性。本专利技术提供的蓝耳病灭活疫苗的制备方法，使用能促进机体产生抗体的中药提取液驯化Marc-145细胞、配制灭活后的猪蓝耳病毒液，制得的灭活疫苗能刺激机体产生抗体，解决了灭活疫苗免疫时机体产生中和抗体时间较长、不能产生高效价的抗体的问题，提高了了灭活疫苗对免疫系统的刺激性。具体实施方式下面结合具体的实施方式来对本专利技术的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施例1中药提取液组分：10g茯苓、6g蒲公英、6g黄芪、3g艾草、10g玉米须、3g菟丝子、2g白术、2g刺五加、2g淫羊藿。制备方法：按重量份配比分别称取茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿，并分别粉碎，然后混合制成药粉；向药粉中加入8倍水浸泡20min后,加热煎煮1h，过滤，得到滤液A和药渣；向药渣中加入5倍80％乙醇，加热到60-70℃，保持恒温30min，过滤，回收乙醇，得到滤液B；将滤液A和滤液B混合后，使用孔径为0.5-10μm的微孔滤膜过滤，灭菌，得到中药提取液1。实施例2中药提取液组分：12g茯苓、8g蒲公英、8g黄芪、4g艾草、12g玉米须、4g菟丝子、3g白术、3g刺五加、3g淫羊藿。制备方法：按重量份配比分别称取茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿，并分别粉碎，然后混合制成药粉；向药粉中加入8倍水浸泡25min后,加热煎煮1.2h，过滤，得到滤液A和药渣；向药渣中加入5倍80％乙醇，加热到60-70℃，保持恒温35min，过滤，回收乙醇，得到滤液B；将滤液A和滤液B混合后，使用孔径为0.5-10μm的微孔滤膜过滤，灭菌，得到中药提取液2。实施例3中药提取液的组分：15g茯苓、10g蒲公英、10g黄芪、5g艾草、15g玉米须、5g菟丝子、4g白术、4g刺五加、4g淫羊藿。制备方法：按重量份配比分别称取茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿，并分别粉碎，然后混合制成药粉；向药粉中加入8倍水浸泡30min后,加热煎煮1.5h，过滤，得到滤液A和药渣；向药渣中加入5倍80％乙醇，加热到60-70℃，保持恒温40min，过滤，回收乙醇，得到滤液B；将滤液A和滤液B混合后，使用孔径为0.5-10μm的微孔滤膜过滤，灭菌，得到中药提取液3。实施例4猪蓝耳病毒液将患有猪蓝耳病的1月龄仔猪剖检，采集肺脏及血清，匀浆研磨后用MEM基础培养基配置成悬浮液，加双抗处理，1500rmp离心20min，取上清液经0.20μm的微孔滤膜除菌，即得猪蓝耳病毒液。实施例5灭活疫苗的制备制备方法，包括以下步骤：(1)培养液的配制：在MEM基础培养基中加入10％新生牛血清、20％中药提取液1配制成培养液A，在MEM基础培养基中加入10％新生牛血清、45％中药提取液1配制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)培养液的配制：在MEM基础培养基中加入新生牛血清、中药提取液配制成培养液A和培养液B；(2)细胞培养：将Marc‑145细胞复苏后，接入到培养液A中进行培养，待Marc‑145细胞长成单层后；从单层细胞中选择无污染、形态正常的Marc‑145细胞接入到培养液B中继续培养，待细胞长到培养液表面的75％～80％时，即得Marc‑145细胞培养液；(3)病毒培养：将猪蓝耳病毒液接入到Marc‑145细胞培养液中，继续培养至85％以上细胞出现CPE后，收获培养病毒液；(4)纯化：将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓,80‑100倍后，采用分子筛层析柱对滤液进行纯化；(5)灭活：采用β‑丙内酯灭活纯化的病毒液后，加入5％左右的中药提取液混合配置成灭活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)培养液的配制：在MEM基础培养基中加入新生牛血清、中药提取液配制成培养液A和培养液B；(2)细胞培养：将Marc-145细胞复苏后，接入到培养液A中进行培养，待Marc-145细胞长成单层后；从单层细胞中选择无污染、形态正常的Marc-145细胞接入到培养液B中继续培养，待细胞长到培养液表面的75％～80％时，即得Marc-145细胞培养液；(3)病毒培养：将猪蓝耳病毒液接入到Marc-145细胞培养液中，继续培养至85％以上细胞出现CPE后，收获培养病毒液；(4)纯化：将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓,80-100倍后，采用分子筛层析柱对滤液进行纯化；(5)灭活：采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后，加入5％左右的中药提取液混合配置成灭活疫苗。2.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的培养液A是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和15-20％的中药提取液。3.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的培养液B是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和35-45％的中药提取液。4.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的中药提取液按重量份计由10-15份茯苓、6-10份蒲公英、6-10份黄芪、3-5份艾草、10-15份玉米须、3-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高骁，
申请(专利权)人：南宁学院，
类型：发明
国别省市：广西,45