C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法技术

C肽化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫分析领域，解决了现有定C‑P检测方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题。该试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒；生物素标记的C肽抗体；吖啶酯标记的C肽抗体；清洗缓冲液；化学发光预激发液；校准品；质控品。检测方法为：样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应，形成生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯溶剂；链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合，形成磁珠‑链霉亲和素‑生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯复合物；加入清洗缓冲液等，计算出C肽浓度。本发明专利技术灵敏度高、特异性好、反应时间短、成本低。

【技术实现步骤摘要】
C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术属于免疫分析
，具体涉及一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
C肽原是由C肽B链、C肽和C肽A链组成。C肽B链是从第1个氨基酸到第30个氨基酸；C肽是从第33个氨基酸到第63个氨基酸；C肽A链是从第66个氨基酸到第86个氨基酸。C肽是通过第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸连接C肽的B连和A链。C肽原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸，生成没有活性的C肽，同时C肽原中的A链和B链连接生成C肽。一分子的C肽原分解为一分子C肽和一分子C-肽。C肽由31个氨基酸分子组成，分子量为3020Da。C肽与C肽以等克分子量从B细胞分泌到血液中，不被肝细胞所摄取，主要在肾脏中代谢并从肾脏排出体外。C肽不受C肽抗体的干扰，对于接受C肽治疗的病人，测定C肽水平可以评估残存β细胞的功能。C肽主要通过肾脏降解和排泄，所以尿液中的C肽浓度高于血清中的浓度。尿C肽具有不受C肽原的影响、留取样本方便等特点，检测24小时尿C肽可反映受检者一段时间内血中C肽的平均值。人胰岛素原(proinsulin)是由胰岛素和C肽组成，具有双重免疫活性，既可与胰岛素抗体结合，又可与C肽抗体结合。在生理情况下，只有极少量的C肽原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放C肽原增多，血中C肽原水平升高。由于C肽原的浓度还不到C肽的十分之一，故一般测得C肽(总C肽)可代表血中的游离C肽。目前用于检测C肽的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，操作简单，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。目前市售的C肽(C-P)检测试剂盒主要分为以下3种：一是ELISA方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株C-P抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株C-P抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中C-P的浓度；二是采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面；三是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株C-P抗体标记生物素，另一株C-P抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C-P抗体-C-P抗原-C-P抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。以上定量检测C-P的方法存在以下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板或固相微粒作为固相载体，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面，将引入更多的影响因素，影响检测结果的灵敏度；3)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器都比较昂贵。
技术实现思路
为了解决现有定量检测C-P的方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题，本专利技术提供一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的C肽化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素包被的磁微粒；生物素标记的C肽抗体；吖啶酯标记的C肽抗体；清洗缓冲液；化学发光预激发液；校准品；质控品。作为优选的实施方式，所述校准品包括低值校准品和高值校准品，所述低值校准品浓度为1ng/ml，所述高值校准品浓度为20ng/ml。作为优选的实施方式，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，所述低值质控品浓度为1ng/ml，所述高值质控品浓度为20ng/ml。作为优选的实施方式，所述化学发光预激发液包括酸性激发液和碱性激发液，所述酸性激发液为硝酸和过氧化氢溶液，所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。作为优选的实施方式，所述清洗缓冲液为PB缓冲液。作为优选的实施方式，所述链霉亲和素包被的磁微粒中，磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10～20)。作为优选的实施方式，所述生物素标记的C肽抗体中，C肽抗体与生物素的摩尔比为1:(5～20)。作为优选的实施方式，所述吖啶酯标记的C肽抗体中，C肽抗体与吖啶酯的摩尔比为1:(5～20)。本专利技术的C肽化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：步骤一、链霉亲和素包被磁微粒取磁微粒，用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次，用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml；按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:(10～20)的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18～24h后，置于磁分离架上分离磁珠；去上清，用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18～24h后，置于磁分离架上分离磁珠；去上清，用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次，用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml，得到链霉亲和素包被的磁微粒，2～8℃保存备用；步骤二、生物素标记C肽抗体取C肽抗体，用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液，用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml；按照C肽抗体与生物素摩尔比为1:(5～20)的比例添加生物素，37℃孵育2～4h进行标记；加入封闭液，37℃孵育2～4h后，用蛋白纯化仪进行纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的C肽抗体；步骤三、吖啶酯标记C肽抗体取C肽抗体，用浓度为20mM的PB缓冲液置换C肽抗体保存液，用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至1mg/ml，按照C肽抗体与吖啶酯摩尔比为1:(5～20)的比例添加吖啶酯，37℃孵育2～4h进行标记；加入封闭液，37℃孵育2～4h后，用蛋白纯化仪进行纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的C肽抗体。作为优选的实施方式，所述封闭液选用浓度为20mM的PB缓冲液，其中含有2～5％的BSA。本专利技术的C肽化学发光免疫检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：步骤一、向样品中依次加入生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体和链霉亲和素包被的磁微粒，样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应，形成生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯溶剂；步骤二、链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C肽抗体-C肽抗原-C肽抗体-吖啶酯复合物；步骤三、加入清洗缓冲液，将杂质清洗去除；步骤四、加入酸性激发液，使吖啶酯游离；步骤五、加入碱性激发液，使吖啶酯发射光子；步骤六、根据样品的光量子数计算出C肽的浓度。本专利技术的有益效果是：与现有技术相比，本专利技术提供的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，能够实现对血清/血浆/尿液中C肽的检测，采用双抗体夹心法，同时利用生物素-亲和素体系级联放大效应，采用吖啶酯瞬时化学发光及磁珠分离技术，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少了反应时间，降低了试剂成本，同时降低了噪音干扰。本专利技术的C肽化学发光免疫检测试剂盒与其他厂家的链霉亲和素磁珠-生物素-C肽抗体相比，具有工艺及操作简单、特异性好、磁珠的分散态良好、磁珠不易凝集、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被的磁微粒；生物素标记的C肽抗体；吖啶酯标记的C肽抗体；清洗缓冲液；化学发光预激发液；校准品；质控品。

【技术特征摘要】
1.C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被的磁微粒；生物素标记的C肽抗体；吖啶酯标记的C肽抗体；清洗缓冲液；化学发光预激发液；校准品；质控品。2.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述校准品包括低值校准品和高值校准品，所述低值校准品浓度为1ng/ml，所述高值校准品浓度为20ng/ml；所述质控品包括低值质控品和高值质控品，所述低值质控品浓度为1ng/ml，所述高值质控品浓度为20ng/ml。3.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液包括酸性激发液和碱性激发液，所述酸性激发液为硝酸和过氧化氢溶液，所述碱性激发液为氢氧化钠溶液。4.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液为PB缓冲液。5.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒中，磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10～20)。6.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的C肽抗体中，C肽抗体与生物素的摩尔比为1:(5～20)。7.根据权利要求1所述的一种C肽化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的C肽抗体中，C肽抗体与吖啶酯的摩尔比为1:(5～20)。8.制备权利要求1至7中任意一项所述的C肽化学发光免疫检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、链霉亲和素包被磁微粒取磁微粒，用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次，用浓度为20mM的PB缓冲液稀释至10mg/ml；按照磁微粒与链霉亲和素质量比为1:(10～20)的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18～24h后，置于磁分离架上分离磁珠；去上清，用浓度为20mM的PB缓冲液清洗3次，加入封闭液...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩美玉，王立英，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22