一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法。本发明专利技术将鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联形成特异性免疫磁珠；利用鼠李糖乳杆菌活细胞对样品中的噬菌体颗粒进行吸附，离心、洗涤后重悬于缓冲液；应用免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌‑噬菌体复合物、磁场分离、PBS洗涤后，以磁性玻碳电极作为工作电极，铅丝与饱和甘汞电极作为对电极和参比电极，测定样品和对照中的电阻值差异，对样品中噬菌体实现快速定量检测。本发明专利技术操作简便，无需培养、耗时短、便于推广使用，适合鼠李糖乳杆菌高密度发酵制备中环境和原材料中噬菌体的检测，便于快速确定污染来源和途径，采取综合防治措施。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法。
技术介绍
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）是目前公认的益生性乳杆菌，具有保持肠道微生态平衡，抑制有害细菌生长，消除过敏等生理功能，已被广泛应用于食品补充剂及益生菌产品中。发酵制备高密度鼠李糖乳杆菌菌粉是功能乳制品及益生菌保健产品的基础，目前该产业目前已经产生了巨大经济与社会效益。然而在发酵过程中，乳酸菌常受到噬菌体侵染，导致活性减弱，发酵迟缓，产品质量下降而造成经济损失。因此克服噬菌体危害是工业化浓缩型菌粉生产中一个亟待解决的问题。鼠李糖乳杆菌噬菌体广泛分布于工厂周边环境、原材料、操作人员、空气与设备、污染来源和途径十分复杂。建立快速准确的噬菌体检测方法对于确定污染源头，采取综合防治措施具有十分重要的意义。常规的双层琼脂平板法是目前使用最广泛的噬菌体检测方法，但是检测周期长，通常需要培养24h以上，在时效性上难以满足发酵生产的要求。近年来PCR技术被应用于快速检测乳杆菌噬菌体和乳酸链球菌噬菌体，虽然检测周期短，但是检测成本高昂，并且只能检测到特定引物靶点噬菌体，噬菌体变异以及靶基因缺失容易造成漏检。利用生物传感器技术检测噬菌体成本低廉、检测灵敏、快捷，但尚处于起步阶段，目前针对鼠李糖乳杆菌工业菌株的噬菌体检测还没有相应方法建立。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术提供一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，应用鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性抗体制备免疫磁珠，联合电化学传感器建立鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量测定方法，为高密度菌粉大规模工业化生产中噬菌体防治提供新技术；主要包括鼠李糖乳杆菌活细胞对样品中的噬菌体颗粒的吸附分离和免疫磁珠对鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物捕获分离及电化学定量检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，包括如下步骤：1）鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，得到SpaA抗体偶联的纳米磁珠；2）鼠李糖乳杆菌特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；3）步骤1）制得的SpaA抗体偶联的纳米磁珠捕获与分离步骤2）制得的鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；4）免疫磁珠电化学传感器定量检测样品中的噬菌体含量。步骤1）中，选择SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，作为鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物的免疫磁珠。步骤2）中，以鼠李糖乳杆菌活细胞特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，通过离心和PBS洗涤，去除非特异性吸附颗粒，以得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物。步骤3）中，以SpaA抗体偶联的纳米磁珠特异性捕获鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物，再通过磁场分离、PBS洗涤，获得SpaA抗体偶联的纳米磁珠-鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物。步骤4）中，以磁性玻碳电极作为工作电极，铅丝与饱和甘汞电极分别用作对电极和参比电极，在铁氰化钾溶液中测定样品和对照中的电阻值差异，根据标准曲线对样品中噬菌体进行定量。具体地，一种李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，其特征在于，具体步骤为：通过鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联形成特异性免疫磁珠；利用鼠李糖乳杆菌活细胞对样品中的噬菌体颗粒进行特异性吸附，得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；应用免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物、通过磁场分离、PBS洗涤后，再用磁性玻碳电极测定免疫磁珠-鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物的电阻值，实现对样品中噬菌体的快速定量检测。更具体地，包括以下步骤：（1）免疫磁珠的制备将羧基修饰的纳米磁珠（MNB）置于1.5mL离心管中，用MEST缓冲液洗涤2次，然后悬浮于500μLEDC-NHSS溶液中。在37℃下活化30min后，应用磁力分离收集MNB，并用500μLPBST悬浮，洗涤3次，加入新的无菌1.5mL离心管中。将鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体（PcAb-SpaA）(100μL)加入溶液，37℃孵育3h，弃上清。将PcAb-SpaA偶联的MNB（PcAb-SpaA-MNB）在含有1%BSA的PBST中于37℃封闭45min，用PBST洗涤3次，用含有0.02%NaN3和0.5％BSA的PBST(200μL)重悬，使终浓度为10mg/ml，4℃保藏备用。（2）鼠李糖乳杆菌活细胞悬液制备将鼠李糖乳杆菌接种至MRS培养基，37℃厌氧培养16h，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次，PBS重悬，调整菌体浓度为OD600=1.0（1×108CFU/mL），制备活细胞悬液，4℃保藏备用。（3）噬菌体捕获取100μL浓度为109PFU/mL鼠李糖乳杆菌噬菌体用PBS稀释到107PFU/mL、106PFU/mL、105PFU/mL、104PFU/mL、103PFU/mL、102PFU/mL制备噬菌体梯度样品，每个浓度做3个平行；对照组用效价为109PFU/mL其它噬菌体，用PBS稀释到107PFU/mL、106PFU/mL、105PFU/mL、104PFU/mL、103PFU/mL、102PFU/mL，每个浓度做3个平行；未加噬菌体的PBS作为空白对照。噬菌体捕获步骤为：取100μL鼠李糖乳杆菌活细胞悬液加入900μL上述噬菌体梯度稀释样品中，充分混匀，室温静置吸附15min；取10μL按步骤（1）制备好的免疫磁珠PcAb-SpaA-MNB加入到各样品中，混合均匀，37℃孵育60min；磁场分离2min后弃上清；用PBS洗涤磁珠-细菌-噬菌体复合物3次，去除非特异性结合的粒子，最终重悬于100μLPBS缓冲液，备用。（4）电化学信号检测将磁性玻碳电极（φ=5mm）依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨电极，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干后，4℃保存备用。将上述按步骤（3）获得的磁珠-细菌-噬菌体复合物悬液，全部滴加至打磨好的玻碳电极上，在电化学工作站进行电化学检测；检测采用三电极体系：磁性玻碳电极(Φ=5mm)作为工作电极，铂丝与饱和甘汞电极(SCE)分别用作对电极和参比电极；反应体系为铁氰化钾溶液（pH=7.4），扫描范围为-0.25V-0.25V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，扫描速率为60mV/s；测定样品电阻值，绘制标准曲线，并分析样品中噬菌体浓度的对应关系，所有测量均在室温下进行。（5）模拟样品中鼠李糖乳杆菌噬菌体的检测取10μL浓度为107PFU/mL鼠李糖乳杆菌噬菌体和10μL浓度为107PFU/mL其它噬菌体混合，加入1mlMRS培养基充分混匀制成样品，以单独加入或者未加鼠李糖乳杆菌噬菌体的MRS作为阳性和阴性对照；用传统双层平板法测定噬菌体含量，具体步骤：取10μL样品用无菌的SM缓冲液对进行梯度稀释，取合适稀释度的稀释液100μL与过夜培养的鼠李糖乳杆菌100μL室温混合15min，加入5mLMCM半固体培养基后，迅速倒入底层平板上，待培养基充分凝固，于37℃恒温培养至出现清晰的噬菌斑，对噬菌体斑数进行计数。用本专利技术免疫磁珠法测定噬菌体的含量，具体步骤为：取100μL鼠李糖乳杆菌活细胞悬液加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，包括如下步骤：1）鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，得到SpaA抗体偶联的纳米磁珠；2）鼠李糖乳杆菌特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，得到鼠李糖乳杆菌‑噬菌体复合物；3）步骤1）制得的SpaA抗体偶联的纳米磁珠捕获与分离步骤2）制得的鼠李糖乳杆菌‑噬菌体复合物；4）免疫磁珠电化学传感器定量检测样品中的噬菌体含量。

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，包括如下步骤：1）鼠李糖乳杆菌菌毛亚基SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，得到SpaA抗体偶联的纳米磁珠；2）鼠李糖乳杆菌特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；3）步骤1）制得的SpaA抗体偶联的纳米磁珠捕获与分离步骤2）制得的鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物；4）免疫磁珠电化学传感器定量检测样品中的噬菌体含量。2.根据权利要求1所述的一种李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，其特征在于，步骤1）中，选择SpaA特异性多克隆抗体与纳米磁珠偶联，作为鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物的免疫磁珠。3.根据权利要求1所述的一种李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法，其特征在于，步骤2）中，以鼠李糖乳杆菌活细胞特异性吸附样品中的噬菌体颗粒，通过离心和PBS洗涤，去除非特异性吸附颗粒，以得到鼠李糖乳杆菌-噬菌体复合物。4.根据权利要求1所述的一种李糖乳杆菌噬菌体的快速定量检测方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振泉，时秒，高璐，胡钦，饶胜其，郑香峰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32