建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒制造技术

一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，属于基因重组及蛋白制备技术领域。本发明专利技术的目的是用SF9细胞表达Flag‑MxA，纯化出MxA蛋白，作为校准品。制备时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试纸卡，用时间分辨荧光免疫法分析仪测定试纸卡荧光强度，进一步获得样品中MxA浓度的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒。本发明专利技术包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体‑荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3‑5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。本发明专利技术采用昆虫细胞系统表达MxA，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产。

【技术实现步骤摘要】
建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒
本专利技术属于基因重组及蛋白制备

技术介绍
感染性疾病是指由致病微生物（细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、真菌等）通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病，其中最常见是细菌和病毒感染，需要快速诊断细菌或病毒感染，指导临床治疗方向。临床上常用检测血清中降钙素原（Procalcitonin,PCT）指标，来快速诊断细菌感染发生，指导抗细菌感染治疗。目前，还没有一个血液学指标能诊断病毒感染发生，需要寻找判定病毒感染血液指标，而血液中单核细胞产生粘病毒抗性基因蛋白A(MyxovirusresistanceproteinA，MxA）有潜力作为病毒感染指标,用于早期诊断病毒感染发生。MxA是血液单核细胞质中蛋白，MxA基因位于21号染色体长臂远端(21q22),经IFN-α/β处理细胞，诱导产生78KDaMxA蛋白，MxA属于大GTP酶的动态蛋白(dynamin)超家族成员，MxA的特征是相对高分子量,自我聚合倾向,相对比较低GTP亲和力和高GTP水解速率，不同种群MxA蛋白间的同源性很高。MxA蛋白主要由3个区域组成:(1)N端GTPase结构域,由约300个氨基酸组成,是GTP酶活性区,包含3个GTP结合基序，1个自我组装区;(2)中央相互作用结构域:约含有150个氨基酸;(3)C端GTPase效应结构域,约含有100个氨基酸,其中含2个亮氨酸拉链结构,形成分子双螺旋结构。
技术实现思路
本专利技术的目的是用SF9细胞表达Flag-MxA，纯化出MxA蛋白，作为校准品。制备时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试纸卡，用时间分辨荧光免疫法分析仪测定试纸卡荧光强度，进一步获得样品中MxA浓度的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒。本专利技术包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。本专利技术硝酸纤维素膜上包被有MxA抗体形成检测线和抗IgG抗体形成质控线。本专利技术荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm；根据权利要求1所述的荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)螯合物中一种；进一步优选为铕螯合物(EuropiumChelate)，激发波长是420nm，发射波长是615nm。本专利技术低渗溶液是Tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm,含0.1-0.5%NP-40,用于裂解细胞，释放出细胞内的蛋白。本专利技术所用时间分辨荧光免疫层析（TRFIA）分析仪，波长350-430nm激发光作用后，延时100-400uS，再测定波长600-650nm荧光强度。本专利技术MxA抗体-荧光微球，选用镧系元素螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理羧基修饰荧光微球后，MxA抗体偶联到上述荧光微球上，MxA抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将MxA抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。本专利技术制备MxA校准品：用PCR从pCS6-MX1扩增出MxADNA（核酸序列1-1989），构建pFastBac-Flag-MxA载体，转导到HD10Bac细菌中，产生重组Flag-MxAAcNPV（昆虫病毒）质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞（SF9细胞），产生重组Flag-MxAAcNPV；此病毒感染SF9细胞后，表达出Flag-MxA蛋白；用Anti-Flag抗体亲和层析法纯化出Flag-MxA蛋白，此纯化Flag-MxA蛋白作为校准品。本专利技术Flag-MxA为校准品，用TRFIA分析仪测定不同浓度MxA校准品试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备MxA浓度标准曲线，建立MxA浓度标准卡，输入到TRFIA分析仪，建立TRFIA分析仪自动显示样品中MxA浓度检测系统。本专利技术采用昆虫细胞系统表达MxA，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产，纯化出MxA具有蛋白自然结构和抗原性，能作为TRFIA检测MxA浓度试剂盒的校准品。附图说明图1是侧向免疫层析法试纸条侧面图；图2是包装外壳后侧向免疫层析法试纸卡示意图；图1和图2中1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫，8是样品窗口，9是检测窗口，10是塑料外壳；图3是侧向免疫层析法试纸条长度示意图；图4是PCR产物；图5是Sall/Xhol切割pFastBac-MxA质粒DNA；图6是Flag-MxAAcNPV重组质粒PCR产物；图7是银染法测定Flag-MxA纯度；图8是MxA抗体的免疫印迹分析；图9是BSA浓度标准曲线；图10是MxA浓度标准曲线；图11是MxA浓度敏感度曲线；图12是MxA蛋白结构示意图。具体实施方式本专利技术是用纯化的重组MxA蛋白为校准品，建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒过程，是表达和纯化出Flag-MxA，及用时间分辨荧光免疫层析法定量检测MxA过程。研究发现，病毒感染人体后，诱导人体细胞分泌的一种具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的宿主特异性糖蛋白，称为干扰素（Interferon，IFN），是机体防御系统的重要组成部分，由于IFN在血液中寿命很短，不适合作为检测指标。I型INF(α/β)进一步诱导人外周血单核细胞，巨噬细胞产生MxA，又称INF诱导蛋白P78(Interferon-InducibleProteinP78,IFI78)，MxA分布于细胞质中的蛋白质,具有广谱的抗病毒活性,对多种RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用，并且MxA水平是代表病毒诱导机体产生IFN状态指标。试验表明，人单核细胞在受到人免疫缺陷病毒（HIV）感染后６小时可产生ＭxA，14天达高峰，ＭxA表达可不依赖IFN的存在。腺病毒３型可诱导ＭxA蛋白产生，ＭxA对病毒反应非常敏感，高度稀释腺病毒３型可以诱导ＭxA产生。单核细胞中MxA基础浓度很低，但Ⅰ型IFN（α/β)及多种病毒诱导后，人外周血单个核细胞中产生大量MxA，尤以人单核白细胞对INF敏感性高，合成大量MxA，可占细胞质蛋白总量0.5%；MxA半衰期较长，达2.5天。MxA表现出基础值低，正常人群中MxA值低于100ng/ml，而病毒感染人群MxA值可高达1000ng/ml以上，适合作为病毒感染早期诊断血液学指标。另外，其它细胞因子，如IL-1或TNFα，不诱导MxA水平增高；细菌、真菌、寄生虫及其它微生物感染，不能诱导细胞MxA表达，表明ＭxA是病毒感染特异性指标。许多病毒种类，包括呼吸道合胞病毒、腺毒毒、轮状病毒、流感病毒、疱疹病毒、EB病毒等，可诱导细胞表达MxA增高，表明ＭxA不是鉴定病毒感染类型的指标。急性感染病人，儿科病人，重症病人，ICU病人，大创伤及休克病人都需要简单，快速鉴别细菌感染或病毒感染，指导药物治疗，并监测病性进展。本专利技术采用侧向免疫层析法（Lateralflowimmunoassay,LFIA）测定外周血单核细胞裂解液中MxA，15分钟内出结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体‑荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3‑5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

【技术特征摘要】
1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：包括试纸卡和低渗溶液；在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MxA抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。2.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：硝酸纤维素膜上包被有MxA抗体形成检测线和抗IgG抗体形成质控线。3.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm；根据权利要求1所述的荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)螯合物中一种；进一步优选为铕螯合物(EuropiumChelate)，激发波长是420nm，发射波长是615nm。4.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：低渗溶液是Tris,磷酸盐，碳酸盐缓冲液，盐浓度低于10mm,含0.1-0.5%NP-40,用于裂解细胞，释放出细胞内的蛋白。5.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒，其特征在于：所用时间分辨荧光免疫层析（TRFIA）分析仪，波长350-430nm激发光作用后，延时100-400uS，再测定波长600-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，李宝民，关恒，张蕾，刘戈，赵青，史永丰，刘宁，李添伟，隋宝珍，张金玲，仇淑园，孙净，黄景林，高敏，孙晓婷，林林，朱道林，孙玉峰，王贺，
申请(专利权)人：吉林大学，长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22