一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用技术

本发明专利技术涉及一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用，所述基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法包括以下步骤：（1）将乙酰胆碱酯酶抗体固定于芯片表面；以及（2）使乙酰胆碱酯酶流入芯片表面从而结合于所述乙酰胆碱酯酶抗体上。

【技术实现步骤摘要】
一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用
本专利技术涉及一种乙酰胆碱酯酶的固定技术，尤其涉及一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶的芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用。
技术介绍
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)也称真性胆碱酯酶，属于丝氨酸水解酶类，主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙，能够快速水解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)，以终止ACh对突触后膜的兴奋作用，保证胆碱能神经信号的正常传递，此外也在红细胞、上皮细胞、内皮细胞、胸腺细胞、肝细胞和成骨细胞中表达，可能与其“非经典”作用相关，比如参与神经生长、细胞分化和细胞黏连等。AChE在药理学研究中备受关注，其抑制剂是治疗阿尔茨海默病的一线药物，也被用于治疗重症肌无力。表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)技术是研究生物分子相互作用的工具，由SPR光学组件、微流控系统、传感芯片、流路系统组成，通过表面等离子共振原理测定生物分子相互作用的信息，传感芯片表面固定一层生物分子识别膜，当待测样品流过芯片表面时，若样品中有能够与芯片表面生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金属膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。通常蛋白可以通过氨基偶联、捕获等方式固定在芯片表面，但是这些固定方式并非适合所有蛋白，氨基偶联的方式对蛋白质量要求比较高，而且可能会对活性造成一些影响，偶联的蛋白活性只能保持一段时间。这种偶联方式是不可逆的，若蛋白失活，这个芯片则不能继续使用，造成芯片的损耗。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法及其在小分子抑制剂研发中的应用，该固定方法可以随时调节偶联量，还可以反复偶联，并且在蛋白纯度不高的时候，也能通过抗体识别，使AChE得到纯化并稳定结合到芯片上。第一专利技术提供一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法，包括以下步骤：(1)将乙酰胆碱酯酶抗体固定于芯片表面；以及(2)使乙酰胆碱酯酶流入芯片表面从而结合于所述乙酰胆碱酯酶抗体上。根据第一专利技术，将AChE抗体固定在芯片表面，保持活性；再将AChE流过芯片表面，AChE抗体识别，会结合在抗体上。这种固定方式比起一般的氨基偶联的方式优点在于可以随时调节偶联量，还可以反复偶联。并且在蛋白纯度不高的时候，也能通过抗体识别，使AChE得到纯化并稳定结合到芯片上。较佳地，所述芯片是表面等离子共振系统中的传感芯片。通过将AChE固定在表面等离子共振系统中的传感芯片表面，能应用于小分子抑制剂的研发，测定小分子抑制剂与乙酰胆碱酯酶之间的亲和力。较佳地，步骤(1)包括：用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化芯片表面；使乙酰胆碱酯酶抗体流入芯片表面从而与芯片表面结合；结合完成后，用乙醇胺封闭芯片表面基团。采用这样的氨基偶联的方式，可以将抗体牢固地固定。较佳地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1，乙酰胆碱酯酶抗体的流速为5-100μL/min，与芯片表面接触时间为15-420s。较佳地，步骤(2)中，用缓冲液将乙酰胆碱酯酶稀释至10～100μg/mL，以5-100μL/min的流速进样并流入芯片表面。较佳地，所述表面等离子共振系统包括：传感芯片；用于向所述传感芯片供给样品的流路系统；用于控制样品流的微流控系统；以及用于检测所述传感芯片表面折光率的变化的表面等离子共振光学组件；所述传感芯片被所述微流控系统包裹在内形成夹心结构。这样，可以使得所述传感芯片表面形成4个流动池，可选择单独、配对、串联使用，增加使用灵活度。第二专利技术提供一种筛选乙酰胆碱酯酶的小分子抑制剂的方法，其特征在于，包括：采用上述任一方法在表面等离子共振系统中的芯片表面固定乙酰胆碱酯酶；测定固定于所述芯片表面的乙酰胆碱酯酶的活性；以及在所述乙酰胆碱酯酶具有活性的情况下，使待选小分子抑制剂流过芯片表面，并测试待选小分子抑制剂与乙酰胆碱酯酶的亲和力。根据第二专利技术，可以方便、稳定地进行乙酰胆碱酯酶的小分子抑制剂的筛选。较佳地，用已知的乙酰胆碱酯酶抑制剂测试乙酰胆碱酯酶的活性，优选地，所述已知的乙酰胆碱酯酶抑制剂选自他克林、毒扁豆碱、多奈哌齐中的任意一种。较佳地，待选小分子抑制剂按两倍梯度稀释，浓度从低到高进样，流速5-100μL/min，结合15-420s，解离15-600s，拟合计算结合解离常数KD。较佳地，在测得乙酰胆碱酯酶失活的情况下，用pH1.5～2.5的酸性缓冲液对芯片表面进行再生，使乙酰胆碱酯酶抗体和失活的乙酰胆碱酯酶解离。附图说明图1：表面等离子共振仪器装置图。图2：AChE抗体偶联图。图3：AChE与抗体稳定结合，说明此抗体能固定AChE。图4：AChE与抗体不能稳定结合，说明此抗体不适合用于AChE的固定。图5：AChE与抗体能结合，但解离迅速，说明此抗体不适合用于AChE的固定。图6：AChE与梯度浓度的tacrine作用图，说明固定的AChE保持了活性。图7：梯度浓度的B9M与AChE结合作用图。图8：B9M亲和力拟合图。图9：梯度浓度的QSJ406与AChE结合作用图。图10：QSJ406亲和力拟合图。图11：梯度浓度的QSJ407与AChE结合作用图。图12：QSJ407亲和力拟合图。图13：梯度浓度的QSJ408与AChE结合作用图。图14：QSJ408亲和力拟合图。具体实施方式以下结合附图和下述实施方式进一步说明本专利技术，应理解，附图和下述实施方式仅用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。在此公开一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法，首先将乙酰胆碱酯酶抗体偶联在芯片上，保持活性；然后将乙酰胆碱酯酶流入芯片表面，被偶联的抗体识别后，会结合在芯片上。优选实施方式中，上述固定方法在表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)系统上进行，所述芯片是表面等离子共振系统中的传感芯片。如图1所示，表面等离子共振系统可包括：SPR光学组件(未图示)、微射流卡盘1、传感芯片2、流路系统3。流路系统3用于向整个SPR系统运送缓冲液以及为传感芯片2供给样品流。微射流卡盘1作为液体传送系统，用于控制向传感芯片2供给的样品流，例如控制其流动的通道和流速等。传感芯片2为一片表面镀有金属薄膜的玻璃载片。微射流卡盘1表面有4个凹槽，与传感芯片2贴合后可形成包括微射流卡盘1、流通池、传感芯片2的夹心结构，组成微流控系统，能将极少量样品及试剂输入流通池，4个流通池可选择单独、配对、串联使用。样品通过微流控系统到达芯片2表面，发生结合后，SPR光学组件能检测到芯片表面折光率的变化，输出信号。如图1所示，流路系统3可包括缓冲液瓶31、与缓冲液瓶连接的流路32。从流路32可分岔出第一流路34和第二流路35。在分岔处可设置有阀门33。可通过调节阀门33使缓冲液瓶31中的缓冲液流入第一流路34和/或第二流路35。第一流路34上设置有缓冲液泵36，无样品时，其用于将缓冲液瓶里的缓冲液输送进入SPR系统。第二流路35上设置有自动进样泵37，当需要进样时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将乙酰胆碱酯酶抗体固定于芯片表面；以及（2）使乙酰胆碱酯酶流入芯片表面从而结合于所述乙酰胆碱酯酶抗体上。

【技术特征摘要】
1.一种基于抗体的乙酰胆碱酯酶芯片固定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将乙酰胆碱酯酶抗体固定于芯片表面；以及（2）使乙酰胆碱酯酶流入芯片表面从而结合于所述乙酰胆碱酯酶抗体上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片是表面等离子共振系统中的传感芯片。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化芯片表面；使乙酰胆碱酯酶抗体流入芯片表面从而与芯片表面结合；结合完成后，用乙醇胺封闭芯片表面基团。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1，乙酰胆碱酯酶抗体的流速为5-100μL/min，与芯片表面接触时间为15-420s。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，用缓冲液将乙酰胆碱酯酶稀释至10～100μg/mL，以5-100μL/min的流速进样并流入芯片表面。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面等离子共振系统包括：传感芯片；用于向所述传感芯片供给样品的流路系统；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昊，徐见容，陈红专，胡梦薇，赵兰雪，侯丽娜，王宇，李苗苗，黄婉莹，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海,31