一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，属于医学体外诊断领域。该试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品；所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂；所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。本发明专利技术的抗凝血酶Ⅲ检测试剂盒中R1和试剂R2均为液体型，开瓶即用，无需复溶，使用方便，储存有效期长达一年，不受血浆样本中HCII的干扰，检测线性范围宽，最高检测限能达到155％。

【技术实现步骤摘要】
一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒
本专利技术属于医学体外诊断领域，具体涉及一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒。
技术介绍
抗凝血酶Ⅲ是血浆中一种丝氨酸蛋白酶抑制物(serineproteaseinhibitor)。因子Ⅱa、Ⅶ、Ⅸa、Ⅹa、Ⅻa的活性中心均含有丝氨酸残基，都属于丝氨酸蛋白酶(serineprotease)。抗凝血酶Ⅲ分子上的精氨酸残基，可以与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合而使之失活。在血液中，每一分子抗凝血酶Ⅲ，可以与一分子凝血酶结合形成复合物，从而使凝血酶失活。发色底物法目前广泛用于实验室研究和体外诊断。其原理是首先人工合成可以被待测凝血活酶催化裂解的化合物，且化合物连接上产色物质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中出现颜色变化，根据颜色变化可推算出被检凝血活酶的活性。掌握抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)的活性作为对于弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合症等疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用AT-Ⅲ浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。AT-Ⅲ是作为血液中活性凝血因子的最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。其血液中AT-Ⅲ的水平根据各种疾病、症状而变化。血液中的AT-Ⅲ水平降低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。AT-Ⅲ病理性增高：表明血液抗凝活性增强，主要见于口服抗凝药、急性出血期等。AT-Ⅲ病理性降低：常见的有先天性AT-Ⅲ缺乏症；血栓前状态和血栓性疾病时，血液抗凝作用减弱，如DIC高凝期、心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、妊娠症、深静脉血栓形成、肾病综合征等；合成减少，如严重肝病等；目前公开的对抗凝血酶的检测主要有三类方法，分别是凝固法、免疫法和发色底物法。凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-Ⅲ活性，凝固法即可以直接使用待测血浆也可以将待测血浆加热脱纤维蛋白然后使用，但是直接使用待测血浆时有多种蛋白酶参与反应，测定结果易受影响。待测血浆加热脱纤维蛋白处理，操作繁杂，而且会导致AT-Ⅲ水平的降低，不利于准确测算。免疫学分析方法包括单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶联免疫吸附法测定样本中AT-Ⅲ的浓度。这种方法特异性好、灵敏度高，但是操作繁琐、耗时，非活性的AT-Ⅲ也参与了免疫学反应，检测的AT-Ⅲ浓度并不能完全反映AT-Ⅲ活性水平。这对于由于AT-Ⅲ活性降低而导致的AT-Ⅲ缺乏的病人来说，检测结果不准确。底物发色法是试剂中的凝血酶在肝素的存在下与待测血浆中的抗凝血酶形成凝血酶和抗凝血酶的复合物，使凝血酶的活性受到抑制。剩余的没有和抗凝血酶Ⅲ形成复合物的凝血酶作用于凝血酶特异发色底物，将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline，pNA)显色基团，这种反应可引起在405纳米处吸光度的变化，而产生的4-硝基苯胺的量是和样品中抗凝血酶的活性成反比的。因此，利用测量405nm处吸光度的变化，可计算出血浆中抗凝血酶Ⅲ的活性水平由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，能够适用于多种自动化分析仪器，且在国产化检测试剂的发展下，大幅降低了临床检测费用，在临床中应用也越加广泛。实际上，虽然此法已在临床应用中广泛使用，但在其测定过程中大多还是有检测结果受血浆中多种干扰物质影响的情况发生。例如肝素辅助因子Ⅱ，对凝血酶具有抑制作用。大约70％的凝血酶抑制活性是由抗凝血酶Ⅲ引起。因此凝血酶的底物发色法不能准确地反映血浆中抗凝血酶Ⅲ的真实水平。为了降低肝素辅因子II的影响，美国专利US5985582和中国专利CN102690862A中，公开了一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒(发色底物法)，试剂盒包含肝素衍生物、凝血酶和发色底物试剂；所述试剂在把肝素加入样本前将其进行酶解得到肝素衍生物。这就增加了试剂制作的成本，工艺变得比较繁琐。由于该技术成本高，并且该现有技术在全自动凝血仪上进行AT-Ⅲ活性检测时需要更改很多参数，操作不方便，结果也容易出现误差。Demers等人(ThrombosisandHemostasia，69(3),pp.231-235(1993))报道采用FXa替代凝血酶，不会受到HCII的抑制，中国专利CN107153043A和CN106153612A公开了一种型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂，也是用FXa替代凝血酶,但是用FX分析成本更高，而且FXa不稳定，操作繁杂，不适合自动分析仪。目前市场上的抗凝血酶Ⅲ的检测试剂多使用冻干粉制剂，然而冻干粉试剂需要冰冻干燥工序，工艺比较复杂，而且在使用时需要复溶，复溶过程中，加样量的不同，都会导致冻干粉制剂瓶间差，批间差很大。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒稳定性差、灵敏度低的问题，而提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒。本专利技术提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品；所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂；所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。优选的是，所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种，所述的凝血酶的浓度为8-20U/mL。优选的是，所述的肝素或其盐优选为肝素或肝素钠，浓度优选为12U/ml。优选的是，所述保护剂包括氨基酸、多元醇、表面活性剂、金属离子螯合剂、无机盐和第一防腐剂；所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的一种或几种，质量体积百分比为1％-20％；所述多元醇选自木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种，质量体积百分比为0.1％-10％；所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、TritonX-100中的一种或几种，质量体积百分比为0.01％-0.5％；所述金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵，质量体积百分比为5％-20％；所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸钾，质量体积百分比为0.5％-10％。优选的是，所述的发色底物选自Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(ChromozymTH)、Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl或H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。优选的是，所述的稳定剂为酪蛋白，质量体积百分比1-10％。优选的是，所述的第一缓冲液和第二缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种。优选的是，所述的第一防腐剂和第二防腐剂分别选自叠氮钠、Proclin300、庆大霉素、硫柳汞。优选的是，所述质控品由动物血浆，添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂冻干制成。优选的是，所述校准品是将正常健康人血浆收集之后混合，然后进行AT-Ⅲ活性检测，检测值应在80％-120％，添加缓冲液、冻干保护剂和防腐剂，分装后冻干，然后用WHO抗凝血酶国际标准品血浆对该校准品进行溯源性定值。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品；该试剂盒将稳定剂酪蛋白用于制备凝血酶发色底物液，能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中。本专利技术的抗凝血酶Ⅲ检测试剂盒中R1和试剂R2均为液体型，开瓶即用，无需复溶，使用方便，储存有效期长达一年，能够有效解决试剂的稳定性问题，稳定性好、灵敏度高、特异性好、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品；所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂；所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。

【技术特征摘要】
1.一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2、质控品和校准品；所述的试剂R1包括凝血酶、肝素或其盐、第一缓冲液和保护剂；所述试剂R2包括凝血酶的发色底物、第二缓冲液、稳定剂和第二防腐剂。2.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种，所述的凝血酶的浓度为8-20U/mL。3.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，所述的肝素或其盐为肝素或肝素钠，浓度为12U/ml。4.根据权利要求1所述的一种液体型抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，所述保护剂包括氨基酸、多元醇、表面活性剂、金属离子螯合剂、无机盐和第一防腐剂；所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的一种或几种，质量体积百分比为1％-20％；所述多元醇选自木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种或几种，质量体积百分比为0.1％-10％；所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、TritonX-100中的一种或几种，质量体积百分比为0.01％-0.5％；所述金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸二钠、酒石酸钾钠、柠檬酸铵，质量体积百分比为5％-20％；所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸钾，质量体积百分比为0.5％-10％。5.根据权利要求1所述的一种液体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘阳，汪一名，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22