建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒制造技术

一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，属于时间分辨免疫荧光检测技术领域。本发明专利技术的目的是采用侧向免疫层析法（Lateral flow immunoassay,LFIA）测定血液中MYBPC3浓度，能在15分钟内出结果，只需简单设备，能满足快速诊断AMI发生要求的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒。本发明专利技术包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MYBPC3抗体‑荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3‑4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。本发明专利技术简单，快速，定量检测血液中MYBPC3浓度，用于早期诊断AMI发生，在临床上有广泛应用，将有很大市场需求。

【技术实现步骤摘要】
建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒
本专利技术属于时间分辨免疫荧光检测

技术介绍
急性心肌梗塞(Acutemyocardialinfarction,AMI)已成为人类死亡的主要原因，由于AMI发病急、死亡率高的特点，AMI的早期诊断和及时治疗是降低AMI死亡率的关键所在。目前，诊断AMI主要是根据典型的临床表现，心电图的改变及实验室指标检测。约25％的AMI病人发病早期临床症状不明显，约50%AMI病人心电图无典型变化，在这种情况下，检测心肌损伤特异性标志物对AMI早期确诊就起到了关键性作用，需要研制出一种灵敏度高、特异性好、临床诊断符合率高、快捷方便的检测心肌损伤特异性指标试剂盒。临床上常检测血液中肌酸激酶MB同功酶（Creatinekinase-MB，CK-MB），肌钙蛋白T（CardiactroponinT，cTnT），肌钙蛋白I(CardiactroponinI，cTnI)心肌损伤标记物，判定AMI发生。CK-MB主要存在于心肌细胞中，是常用的心肌损伤标志物之一，CK-MB在AMI发病后4〜8h内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。血清中CK-MB虽然具有较高的灵敏度，但心肌与骨骼肌中CK-MM有交叉反应，特异性不高，"窗口期"短（开始升高的时间较晚及持续时间较短），CK-MB不是判定心肌组织损伤特异性指标。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用侧向免疫层析法（Lateralflowimmunoassay,LFIA）测定血液中MYBPC3浓度，能在15分钟内出结果，只需简单设备，能满足快速诊断AMI发生要求的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒。本专利技术包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MYBPC3抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。本专利技术硝酸纤维素膜上包被有MYBPC3抗体形成检测线和抗IgG抗体形成质控线。本专利技术荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm。本专利技术荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)元素螯合物中的一种;本专利技术优先选用铕螯合物(EuropiumChelate)，其荧光激发波长是420nm，发射波长是615nm。本专利技术用时间分辨荧光（TRFIA）分析仪检测时，在激发光（波长350-430nm）作用后，延时100-400uS，再测定试纸卡荧光（波长600-650nm）强度。本专利技术MYBPC3抗体-荧光微球,选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，用碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)处理羧基修饰荧光微球后，MYBPC3抗体偶联到上述荧光微球上，MYBPC3抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将MYBPC3抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用；选用MYBPC3抗体识别心肌型MYBPC3抗原表位,而不结合骨骼肌型MYBPC3抗原。本专利技术纯化MYBPC3为校准品，用TRFIA分析仪测定不同浓度MYBPC3校准品在试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备MYBPC3浓度标准曲线，建立MYBPC3浓度标准卡，输入到TRFIA分析仪，建立TRFIA分析仪自动显示样品中MYBPC3浓度检测系统，用于检测血清，血浆，及全血中MYBPC3浓度。本专利技术简单，快速，定量检测血液中MYBPC3浓度，用于早期诊断AMI发生，在临床上有广泛应用，将有很大市场需求。用于判断急性心肌梗塞发生。附图说明图1是侧向免疫层析法试纸条侧面图；图2是包装外壳后侧向免疫层析法试纸卡示意图；图1和图2中1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫，8是样品窗口，9是检测窗口，10是塑料外壳；图3是MYBPC3浓度标准曲线；图4是MYBPC3浓度敏感度曲线；图5是MYBPC3蛋白结构示意图。具体实施方式cTnT和cTnI(cTn)仅存在于心肌细胞中，可用免疫学方法测定，对心肌损伤的诊断具高度敏感和特异性用于临床诊断AMI。cTnT在心肌损伤后3-6小时释放入血，12小时达高峰，升高倍数可达30〜200倍，在血中可维持14天左右，所以它的最大有效诊断窗口宽至2小时-14天。在心肌损伤后，cTnT较cTnl更早释放入血，更易被检测到，血中浓度更高，对检测心肌损伤的价值也就可能更高。AMI理想标志物是在心肌梗死后，从心肌细胞快速释放到血液中，而心脏肌球蛋白结合蛋白C(Myosin-BindingProteinC,Cardiac-Type，MYBPC3或cMyBP-C)更符合这一标准。人MYBPC3基因位于11号染色体（11p11.2）上，含有35个外显子，编码1273个氨基酸残基组成MYBPC3蛋白，属于Ⅲ型纤连蛋白超家族和免疫球蛋白超家族，含有３个Ⅲ型纤连蛋白结构域（Fibronectintype3，FN3）和８个免疫球蛋白样结构域（Immunoglobulin,Ig），Pro-Ala结构域（PAdomain），Myosin(S2)结合区（Mdomain）。FN3是两片反向平行的β⁃链形成的层状结构，含FN3的多为受体蛋白；Ig由约70-110氨基酸组成，是两层反向平行的β⁃折叠链形成的层状结构，看MYBPC3蛋白结构示意图。MYBPC3参与肌节蛋白的结构和功能，MYBPC3的C10结构域与肌球蛋白纤维结合，而C8～C10结构域结合肌联蛋白（Titin），有稳定肌小节结构作用。MYBPC3在C1和C2结构域之间有个特定区域，Mdomain与肌球蛋白（Myosin）颈部结合，也是MYBPC3磷酸化部位（Phosphorylationsites），作为cAMP依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点，磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，MYBPC3不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。机体内存在3种不同的MyBP-C异构体，通过不同基因编码，但3种MyBP-C异构体氨基酸序列有很高同源性.与骨骼肌型MyBP-C相比较，心脏型MyBP-C的N-端具有独特结构域（C0)并具有特异性抗原表位，可用免疫学方法特异性测定出心脏型MyBP-C。MYBPC3是心肌细胞特有的粗肌丝结构蛋白之一，AMI发生时，血清MYBPC3浓度快升高，主要由于MYBPC3具有高度的可溶性及对蛋白水解酶非常敏感，在心肌缺血时，蛋白水解酶被启动并水解粗肌丝蛋白，MYBPC3去磷酸化并释放入血，导致血清中MYBPC3浓度在短时间内急剧升高。MYBPC3在AMI发生后，2小时释放入血，4-6小时达高峰，在12小时，MYBPC3恢复至基线水平。研究发现，需要3-9mg心肌坏死时，能测出cTNT/I水平增高；而0.07mg心肌坏死时，就能测出MYBPC3水平增高。由于MYBPC3分子量大，在AMI超早期，完整的MYBPC3及其水解产物持续大量释放入血，能高于cTNT/I数倍，甚至数十倍，易于检测，测定血液中MYBPC3浓度，可成为超早期诊断AMI敏感和特异性指标。AMI是急症，需要快速诊断和治疗。本专利技术采用侧向免疫层析法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MYBPC3抗体‑荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3‑4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。

【技术特征摘要】
1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：包括试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有MYBPC3抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡。2.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：硝酸纤维素膜上包被有MYBPC3抗体形成检测线和抗IgG抗体形成质控线。3.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：荧光微球表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，直径为100-500nm。4.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：荧光微球标记镧系元素螯合物，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)元素螯合物中的一种;本发明优先选用铕螯合物(EuropiumChelate)，其荧光激发波长是420nm，发射波长是615nm。5.根据权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，其特征在于：用时间分辨荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王珺楠，李宝民，关恒，赵青，张金玲，刘戈，史永丰，刘宁，李添伟，隋宝珍，仇淑园，孙晓婷，孙净，黄景林，高敏，林林，朱道林，孙玉峰，王贺，
申请(专利权)人：吉林大学，长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22