一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产维生素C前体2‑酮基‑L‑古龙酸的方法，该方法将过表达D‑山梨醇脱氢酶(SLDH)的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，伴生菌)与产酸菌普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)混合培养，发酵制备2‑酮基‑L‑古龙酸。本发明专利技术方法实现了从D‑山梨醇到2‑酮基‑L‑古龙酸的“一锅法”转化，简化了生产工艺，缩短发酵周期，有效降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法
本专利技术涉及发酵
，尤其是涉及一种仅有地衣芽孢杆菌及生酮基古龙酸菌两种菌株参与的发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法。
技术介绍
维生素C(VitaminC，简称Vc)，又名L-抗坏血酸，是一种维持机体正常生理功能的水溶性维生素，广泛应用于食品、医药、饲料、化妆品等行业。目前工业上维生素C的生产方法主要是莱氏法和二步发酵法，其中二步发酵法是我国维生素C生产企业普遍采用的方法。二步发酵法第一步是用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxyans)将D-山梨醇转化为L-山梨糖；第二步是由普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare，俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium，俗称大菌)组成的混菌体系将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-Gulonicacid,2-KLG)。相比于莱氏法，二步发酵法的优势在于用一种混合微生物发酵体系，替代化学法转化L-山梨糖合成维生素C的生产前体2-酮基-L-古龙酸，在减少环境污染的同时，简化了生产工艺，且大大降低了生产成本。二步发酵法的混菌体系中产酸菌K.vulgare单独培养时生长缓慢，几乎不产酸，需要伴生菌存在促进K.vulgare生长和2-酮基-L-古龙酸的积累。目前报道的伴生菌有地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)等。尽管目前维生素C的生产体系已经运行多年，但二步发酵法也存在诸多问题，如“三菌二步”生产工艺较复杂，发酵周期长，能耗高，且常用伴生菌巨大芽孢杆菌(B.megaterium)易受噬菌体污染等。此外，由于该混菌体系中的菌株均为非模式微生物，遗传背景和代谢途径研究有限且相互作用复杂，在生产中难于对混菌生长和生产过程进行有效的人工调控。基于经典的二步发酵法，相继开发了从D-葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸的新二步发酵法，以及共表达醇糖脱氢酶系(SLDH、SDH、SNDH)的一菌一步发酵法。这些方法在一定程度上简化了维生素C的生产工序，然而新两步发酵法的中间产物2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)高度不稳定，一步发酵法中醇糖脱氢酶系的表达效率和醇糖跨膜转运等问题都限制了二者工业化生产。因此，保留K.vulgare为产酸菌，通过伴生菌变化的“两菌一步”法将有可能改进原有生产工艺。现有应用实例是利用氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)作为伴生菌的“两菌一步”法，但该方法的伴生菌G.oxydans与产酸菌K.vulgare会竞争利用L-山梨糖，从而影响到转化效率，且G.oxydans为好氧菌，不适合与兼性厌氧的产酸菌K.vulgare共培养。随着维生素C市场需求的不断扩大以及市场竞争的日趋激烈，探究新的维生素C生产方法至关重要。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法。本专利技术方法实现了从D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的“一锅法”转化，简化了生产工艺，缩短发酵周期，有效降低了生产成本；同时地衣芽孢杆菌与产酸菌同为兼性厌氧菌，其作为工业菌株发酵条件相对简单且易于控制，发酵过程不易染菌，容易实现工业化；进一步地，本专利技术敲除了地衣芽孢杆菌D-山梨醇分解代谢相关基因，提高了底物利用率，从而有效地提高了产酸率。本专利技术的技术方案如下：一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，该方法将过表达D-山梨醇脱氢酶(SLDH)的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis，伴生菌)与产酸菌普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)混合培养，发酵制备2-酮基-L-古龙酸；所述D-山梨醇脱氢酶基因为GeneBank中基因序号为BSU_06150、BSU06150、BAMF_RS23545、BAMF_0606、BG04_RS01040、BG04_127、S101359_RS03240、S101359_00640、AB185_RS24215、AB185_24180、SCO1682、SCI30A.03中的一种或多种。本专利技术提供一种山梨醇分解代谢相关基因缺失的地衣芽孢杆菌及其用途，所述山梨醇分解代谢相关基因为GeneBank中基因序号为TRNA_RS40500、BL02489、TRNA_RS40505、BL02490、TRNA_RS40495、BL02487中的一种或多种。在一些实施方案中，所述山梨醇分解代谢相关基因在GeneBank中的基因序号为TRNA_RS40500。所述方法中发酵过程为：发酵罐按装料系数40％-60％装发酵培养基，以山梨醇计初始投入料为3-5％，8-12h后开始匀速流加剩余3-5％；在培养温度30-37℃、搅拌速度300rpm-600rpm、通气量1.0vvm-1.5vvm条件下发酵20h-60h；种子液活菌数为1.5×1010-3×1010，接种量为8％-10％；地衣芽孢杆菌与产酸菌比例为5:1-8:1。在一些实施方案中，接种量为10％，地衣芽孢杆菌和产酸菌K.vulgare比例为5:1，发酵罐装料系数约为42％，山梨醇初始投入料为5％，，8h后开始匀速流加剩余5.0％山梨醇，发酵过程控制pH7.0，在培养温度30℃，搅拌转速500rpm，通气量1.5vvm的条件下培养48h。在一些优选方案中，接种量为10％，地衣芽孢杆菌和产酸菌K.vulgare比例为5:1，发酵罐装料系数约为42％。初始投入5.0％的山梨醇，搅拌转速400rpm，培养温度37℃；8h后开始匀速流加剩余5.0％山梨醇，搅拌转速600rpm，培养温度30℃。发酵过程控制pH7.0，通气量1.5vvm，发酵周期48h。所述过表达D-山梨醇脱氢酶(SLDH)的重组地衣芽孢杆菌的制备方法如下所述：将D-山梨醇脱氢酶基因分别在地衣芽孢杆菌中整合表达和游离表达或将二者结合，构建高表达D-山梨醇脱氢酶的重组地衣芽孢杆菌，进一步通过诱变筛选获得具有高活性D-山梨醇脱氢酶的重组地衣芽孢杆菌；所述D-山梨醇脱氢酶的基因为GeneBank中基因序号为BSU_06150、BSU06150、BAMF_RS23545、BAMF_0606、BG04_RS01040、BG04_127、S101359_RS03240、S101359_00640、AB185_RS24215、AB185_24180、SCO1682、SCI30A.03中的一种或多种。在一些实施方案中，所述D-山梨醇脱氢酶基因在GeneBank中的基因序号为SCO1682。一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，更详尽的步骤为：(1)利用基因敲入技术，将D-山梨醇脱氢酶基因整合至地衣芽孢杆菌基因组上，构建表达D-山梨醇脱氢酶的重组地衣芽孢杆菌，记为BV1；(2)构建游离表达D-山梨醇脱氢酶的重组质粒，通过电转化方法将游离表达D-山梨醇脱氢酶的重组质粒转入地衣芽孢杆菌BV1中，构建过表达D-山梨醇脱氢酶的重组地衣芽孢杆菌，记为BV2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产维生素C前体2‑酮基‑L‑古龙酸的方法，其特征在于，该方法将过表达D‑山梨醇脱氢酶(SLDH)的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，伴生菌)与产酸菌普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)混合培养，发酵制备2‑酮基‑L‑古龙酸；所述D‑山梨醇脱氢酶的基因为Gene Bank中基因序号为BSU_06150、BSU06150、BAMF_RS23545、BAMF_0606、BG04_RS01040、BG04_127、S101359_RS03240、S101359_00640、AB185_RS24215、AB185_24180、SCO1682、SCI30A.03中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，该方法将过表达D-山梨醇脱氢酶(SLDH)的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis，伴生菌)与产酸菌普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)混合培养，发酵制备2-酮基-L-古龙酸；所述D-山梨醇脱氢酶的基因为GeneBank中基因序号为BSU_06150、BSU06150、BAMF_RS23545、BAMF_0606、BG04_RS01040、BG04_127、S101359_RS03240、S101359_00640、AB185_RS24215、AB185_24180、SCO1682、SCI30A.03中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组地衣芽孢杆菌中山梨醇分解代谢相关基因缺失；所述山梨醇分解代谢相关基因为GeneBank中基因序号为TRNA_RS40500、BL02489、TRNA_RS40505、BL02490、TRNA_RS40495、BL02487中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中发酵过程为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：石贵阳，吴志勇，李由然，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32