一种蛋氨酸寡肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种蛋氨酸寡肽及其制备方法和应用，该蛋氨酸寡肽的制备方法包括如下步骤：将蛋白酶溶于缓冲液并离心，得到浓度为22‑28mg/ml的蛋白酶溶液；将L‑Met‑OEt.HCl溶于缓冲液并水浴，得到浓度为0.24‑0.26M的L‑Met‑OEt.HCl溶液；将蛋白酶溶液与L‑Met‑OEt.HCl溶液按照体积比为1∶(0.8‑1.2)混合，并在48‑52℃下进行反应，随后，对反应液中蛋白酶进行灭活处理；将灭活处理后的混合液冷却、离心收集沉淀物，再将沉淀物进行水洗、冷冻干燥即得蛋氨酸寡肽；上述制备方法能够得到包含蛋氨酸二肽至十肽中任意一种或多种成分的蛋氨酸寡肽，而且产率高；此外，采用原料较少，制备工艺简单，易于操作。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋氨酸寡肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及蛋氨酸寡肽
，具体而言，涉及一种蛋氨酸寡肽及其制备方法和应用。
技术介绍
蛋氨酸是植物蛋白源中重要的限制性必需氨基酸，其广泛应用于畜禽水产饲料中，为达到氨基酸平衡的目的，其常以晶体氨基酸盐或包埋的形式补充；然而，采用上述补充方式存在晶体蛋氨酸在水中易溶失，而且晶体蛋氨酸和蛋白质结合态蛋氨酸吸收不同步问题；降低了蛋氨酸的利用率。例如，公开号为CN102429109A的中国专利申请，公开了一种蛋氨酸寡肽，该蛋氨酸寡肽的制备方法为：首先将蛋氨酸乙酯盐酸盐(H-Met-OEt.HCl)配成300mg/ml的pH为5.5的柠檬酸钠溶液；其次将木瓜蛋白酶溶解于含0.1M的半胱氨酸和10mMEDTA的pH为6.5的水溶液中制成木瓜蛋白酶溶液；然后将木瓜蛋白酶溶液按照质量比1∶200加入到蛋氨酸乙酯盐酸溶液中，37℃条件下反应2h；收集沉淀后，上清液中再按质量比1∶200加入木瓜蛋白酶溶液，在37℃条件下反应过夜；反应结束后，用蒸馏水稀释产品，并加热至90℃来灭活蛋白酶；将水不溶物在蒸馏水中洗三次，冷冻干燥产品即制得蛋氨酸寡肽混合物。但该制备方法制备得到的蛋氨酸寡肽为二肽至八肽的混合物，而且产率较低，反应过程使用试剂较多，反应较繁琐。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛋氨酸寡肽的制备方法，该制备方法能够得到包含蛋氨酸二肽至十肽中任意一种或多种成分的蛋氨酸寡肽，而且产率高；此外，采用原料较少，制备工艺简单，易于操作。本专利技术的另一目的在于提供一种蛋氨酸寡肽，该蛋氨酸寡肽不易溶于水，并且利于吸收利用。本专利技术的目的还在于提供一种蛋氨酸寡肽在畜禽水产饲料中的应用，该应用解决了蛋氨酸易于在水中溶失，并能够促进蛋氨酸寡肽释放的蛋氨酸与饲料中蛋白质结合态蛋氨酸同步吸收，提高了蛋氨酸的利用率。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一种蛋氨酸寡肽的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将蛋白酶溶于缓冲液并离心，得到浓度为22-28mg/ml的蛋白酶溶液；(b)将L-Met-OEt.HCl(L-蛋氨酸乙酯盐酸盐)溶于缓冲液并水浴，得到浓度为0.24-0.26M的L-Met-OEt.HCl溶液；(c)将蛋白酶溶液与L-Met-OEt.HCl溶液按照体积比为1∶(0.8-1.2)混合，并在48-52℃下进行反应，随后，对反应液中蛋白酶进行灭活处理；(d)将灭活处理后的混合液冷却、离心收集沉淀物，再将沉淀物进行水洗、冷冻干燥即得蛋氨酸寡肽。本专利技术通过对蛋白酶和L-Met-OEt.HCl浓度的限定，以及对反应温度的限制，能够提高蛋白酶的活性，促进蛋氨酸寡肽的生成，提高蛋氨酸寡肽的产率；此外，本专利技术中通过对蛋白酶进行离心处理，能够活化蛋白酶，利于提高蛋氨酸寡肽的生成效率。在本专利技术中对缓冲液不作严格限制，优选地，所述缓冲液的浓度为0.8-1.2M；PH为7-7.2；更优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液；具体地，所述磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸钾缓冲液。本专利技术通过对缓冲液种类以及PH值的具体限定，提高了蛋白酶活性，提高蛋氨酸寡肽的生成速度。优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。优选地，所述步骤(a)中，离心转速为10000-15000r/min；离心温度为23-27℃；离心时间4-6min。优选地，所述水浴温度为45-55℃；水浴时间为0.5-1.5min；优选地，所述反应时间为10-12h；所述灭活处理为在90-92℃下处理4-6min。作为本专利技术的一种优选方式，所述制备方法还包括采用UPLC对得到的蛋氨酸寡肽进行分离纯化；优选地，所述UPLC以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为乙腈；流动相B为0.1％甲酸。优选地，所述梯度洗脱程序为：0-0.1min时，流动相A95v/v％、流动相B5v/v％；15min时，流动相A60v/v％、流动相B40v/v％，Curve为6；17min时，流动相A100v/v％、流动相B0v/v％，Curve为6；17.1min时，流动相A5v/v％、流动相B95v/v％，Curve为6。优选地，所述UPLC色谱柱为BEHC18；更优选地，所述色谱柱规格长度为100-150mm，内径为2.1-3.0mm，填料粒径为1.0-2.0μm；所述色谱柱的柱温为43-47℃；所述梯度洗脱的流速为0.2-0.4ml/min。通过上述对蛋氨酸寡肽的分离纯化，能够实现对蛋氨酸寡肽的快速、准确的分离，能够分离得到蛋氨酸二肽至十肽中任意单一的蛋氨酸寡肽。本专利技术第二方面提供一种蛋氨酸寡肽，该蛋氨酸寡肽由上述制备方法制备得到。优选地，所述蛋氨酸寡肽包含蛋氨酸二肽至十肽中的任意一种或多种。本专利技术第三方面提供一种蛋氨酸寡肽在畜禽水产饲料中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：(1)本专利技术蛋氨酸寡肽的制备方法能够得到包含蛋氨酸二肽至十肽中任意一种或多种成分的蛋氨酸寡肽，而且产率高；此外，采用原料较少，制备工艺简单，易于操作。(2)本专利技术制备得到的蛋氨酸寡肽不易溶于水，并且利于吸收利用。(3)本专利技术将蛋氨酸寡肽应用在畜禽水产饲料中解决了蛋氨酸易于在水中溶失，并能够促进蛋氨酸寡肽释放的蛋氨酸与饲料中蛋白质结合态蛋氨酸同步吸收，提高了蛋氨酸的利用率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例4中蛋氨酸寡肽的色谱图；图2为本专利技术色谱图中4.18min时洗脱样本的质谱图；图3为本专利技术色谱图中5.71min时洗脱样本的质谱图；图4为本专利技术色谱图中5.81min时洗脱样本的质谱图；图5为本专利技术色谱图中6.92min时洗脱样本的质谱图；图6为本专利技术色谱图中7.55min时洗脱样本的质谱图；图7为本专利技术色谱图中7.96min时洗脱样本的质谱图；图8为本专利技术色谱图中8.73min时洗脱样本的质谱图；图9为本专利技术色谱图中8.88min时洗脱样本的质谱图；图10为本专利技术色谱图中9.66min时洗脱样本的质谱图；图11为本专利技术色谱图中9.78min时洗脱样本的质谱图；图12为本专利技术色谱图中10.41min时洗脱样本的质谱图；图13为本专利技术色谱图中10.70min时洗脱样本的质谱图；图14为本专利技术色谱图中11.10min时洗脱样本的质谱图；图15为本专利技术色谱图中11.57min时洗脱样本的质谱图；图16为本专利技术色谱图中11.85min时洗脱样本的质谱图；图17为本专利技术色谱图中12.59min时洗脱样本的质谱图；图18为本专利技术色谱图中13.06min时洗脱样本的质谱图；图19为本专利技术色谱图中13.44min时洗脱样本的质谱图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋氨酸寡肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)将蛋白酶溶于缓冲液并离心，得到浓度为22‑28mg/ml的蛋白酶溶液；(b)将L‑Met‑OEt.HCl溶于缓冲液并水浴，得到浓度为0.24‑0.26M的L‑Met‑OEt.HCl溶液；(c)将蛋白酶溶液与L‑Met‑OEt.HCl溶液按照体积比为1∶(0.8‑1.2)混合，并在48‑52℃下进行反应，随后，对反应液中蛋白酶进行灭活处理；(d)将灭活处理后的混合液冷却、离心收集沉淀物，再将沉淀物进行水洗、冷冻干燥即得蛋氨酸寡肽。

【技术特征摘要】
1.一种蛋氨酸寡肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)将蛋白酶溶于缓冲液并离心，得到浓度为22-28mg/ml的蛋白酶溶液；(b)将L-Met-OEt.HCl溶于缓冲液并水浴，得到浓度为0.24-0.26M的L-Met-OEt.HCl溶液；(c)将蛋白酶溶液与L-Met-OEt.HCl溶液按照体积比为1∶(0.8-1.2)混合，并在48-52℃下进行反应，随后，对反应液中蛋白酶进行灭活处理；(d)将灭活处理后的混合液冷却、离心收集沉淀物，再将沉淀物进行水洗、冷冻干燥即得蛋氨酸寡肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为0.8-1.2M；pH值为7-7.2；优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液；优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，离心转速为10000-15000r/min；离心温度为23-27℃；离心时间4-6min。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水浴温度为45-55℃；水浴时间为0.5-1.5min；优选地，所述反应时间为10-12h；优选地，所述灭活处理为在90-92℃下处理4-6min。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文兵，谢方丽，徐玮，麦康森，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37