一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用，首先确定maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息，设计10对检测maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态的特异性引物。利用该引物特异性的扩增maspin编码序列上游调控区域中包含CpG岛的不同长度的序列，进行后续甲基化定量检测。该方法可检测乳腺癌患者乳腺癌组织或者乳腺癌转移部位maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态，诊断该病人是否已经发生乳腺癌转移、恶性程度等，辅助临床上对乳腺癌分期分型及治疗；也可检测正常人乳腺maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态，判断其发病几率、是否会发生乳腺癌转移、恶性程度等，辅助乳腺癌早期筛查，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用
本专利技术涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用。
技术介绍
国际癌症研究机构2012年提供了全球范围内癌症发病率、死亡率和流行率的估计数据，以及国家和地区的数据。该大数据表明，乳腺癌是最常被诊断出的癌症，也是全球女性癌症死亡的主要原因，2012年估计有170万例病例和521,900例死亡。仅乳腺癌就占所有癌症病例的25％，占所有癌症死亡人数的15％。据卫生部最新发布的调查报告显示，在我国，乳腺癌已成为上升幅度最快的恶性肿瘤之一。在过去30年中，上升比例高达96％，仅次于肺癌。在情况最严重的上海，发病率达到了52.98/10万；在北京，乳腺癌的发病率也高达33.7/10万，年均增长速度甚至高出欧美国家1～2个百分点。目前，我国的乳腺癌已步入每年约2％～3％的快速增长期，发病高峰以40岁左右的女性为主。因此对于乳腺癌的预防和诊断的研究具有深远而现实的意义。目前，乳腺癌筛查最常用的影像学方法是钼靶X线和超声。乳腺钼靶，全称乳腺钼靶X线摄影检查，又称钼钯检查，是目前诊断乳腺疾病的首选和最简便、最可靠的无创性检测手段，痛苦相对较小，简便易行，且分辨率高，重复性好，留取的图像可供前后对比，不受年龄、体形的限制，目前已作为常规的检查。它的特点是可以检测出医生触摸不到的乳腺肿块，特别是对于大乳房和脂肪型乳房，其诊断性可高达95％，对于以少许微小钙化为唯一表现的T0期乳腺癌(临床门诊阴性)，也只有凭借软X线检查才能被早期发现和诊断，对乳腺癌的诊断敏感性为82％～89％，特异性为87％～94％。但乳腺钼靶对肿瘤风险较高的致密性乳腺敏感度不高。超声检查简便易行，对浸润性乳腺癌较钼靶X线检查敏感。随着超声弹性成像、超声造影、超声三维成像等超声影像学新技术的迅猛发展及应用，超声波检查在乳腺癌的早期诊断中发挥越来越重要的作用。随着对乳腺癌研究的深入，钼靶X线和超声检查等现有检测诊断技术仍有以下明显短板：(1)不能检测早期原位乳腺癌的发生，即当乳腺癌发生早期没有形成明显肿瘤或者肿瘤块较小时，很难检测到。(2)很难预测乳腺癌是否会转移。(3)很难检测乳腺癌的早期转移。总之，现有检测技术已不能满足临床医师对肿瘤患者进行术前病理组织学分级、预估肿瘤分子分型的要求。失去对增殖的控制和对细胞凋亡/坏死的抗性被认为是包括乳腺癌在内的许多癌症类型的标志。在原发性肿瘤形成之后，可能发生转移，由此细胞获得迁移能力，侵入周围组织，进入血液和淋巴系统，然后渗出并定植于二级位点。转移部位的复发是乳腺癌患者死亡的主要原因。maspin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是蛋白酶抑制剂serpin家族的成员，可作为肿瘤抑制基因，maspin已被证明可抑制细胞运动、侵袭和转移。maspin基因表达的丧失是乳腺癌中的常见事件，其导致侵袭潜力增加和转移性疾病的传播。乳腺癌细胞中maspin基因表达的丧失不是由于maspin基因的丢失或重新排列，而是由于调节maspin表达的因子在癌症进展期间被破坏。肿瘤抑制基因启动子中CpG二核苷酸的异常胞嘧啶甲基化通常与其致癌作用和癌症进展过程中染色质结构的变化及其转录沉默有关。研究表明，DNA高甲基化导致人乳腺癌中maspin基因的沉默。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术提供了一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的在于提出了maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛，所述maspin基因编码序列上游调控区域序列如SEQIDNO.1所示；所述CPG岛位于2072–2173bp之间，长度为102bp。本专利技术的第二个目的在于提出了检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物，所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQIDNO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQIDNO.12～21所示。本专利技术的第三个目的在于提出一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，包括检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物和PCR工作液；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQIDNO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQIDNO.12～21所示。进一步地，所述试剂盒包括浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBRPremixExTaqII2×、2μLDNA模板和6μL灭菌水。本专利技术的第四个目的在于提出一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，包括如下步骤：(1)提取组织样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测；(2)亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量；(3)设计检测maspin编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQIDNO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQIDNO.12～21所示；(4)以回收的DNA为模板、以每对特异性引物为引物分别进行荧光定量PCR；(5)计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，分析待测样本甲基化检测结果；20％＜W≤30％时，待测样本为可能发生乳腺癌样本；30％＜W≤50％时，待测样本为已发生非转移乳腺癌样本；50％＜W≤80％时，待测样本为已发生转移乳腺癌样本。进一步地，所述步骤(1)中组织样本选自乳腺组织样本、乳腺癌组织样本、乳腺癌转移部位组织样本。进一步地，所述步骤(4)中PCR反应体系为：浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBRPremixExTaqII2×、2μLDNA模板和6μL灭菌水。进一步地，所述步骤(4)中PCR反应程序为：95℃5min,(95℃10s,95℃20s,68℃for20Sec)40个循环,95℃10s,meltcurve。本专利技术的第五个目的在于提出上述任一项的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法在乳腺癌诊断中的应用。本专利技术的技术方案的原理为：(1)DNA甲基化及甲基化特异性的原理：DNA甲基化主要发生位点是CpG岛。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。甲基化特异性PCR基本原理为：单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化DNA序列区分开来。(2)本专利技术确定了maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛，其特征在于，所述maspin基因编码序列上游调控区域序列如SEQ ID NO.1所示；所述CPG岛位于2072–2173bp之间，长度为102bp。

【技术特征摘要】
1.maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛，其特征在于，所述maspin基因编码序列上游调控区域序列如SEQIDNO.1所示；所述CPG岛位于2072–2173bp之间，长度为102bp。2.检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQIDNO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQIDNO.12～21所示。3.一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，包括检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物和PCR工作液；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQIDNO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQIDNO.12～21所示。4.根据权利要求3所述的一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBRPremixExTaqII2×、2μLDNA模板和6μL灭菌水。5.一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取组织样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测；(2)亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量；(3)设计检测maspin编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，李佳蓬，张慧敏，项园，李含含，黄凤，戴周彤，张子健，王君，李会，李慧，张晓宇，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42