一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法技术

本发明专利技术公开了一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，该方法选用制革过程的中间物—浸酸皮为原料并进行简单的中和预处理，提取阶段以醋酸‑蛋白酶浸提得到酶溶胶原，纯化阶段利用高速离心和多次盐析除杂，最后透析除盐、冻干得到海绵状牛皮胶原，干重提取率＞25％，提取出的产品纯度高，品质优良。十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示胶原含有一条β链和两条α链，保留有完整的三股螺旋结构，分子量分别约为20万和10万，无其他杂蛋白条带，表明所得到的胶原保留了典型的三股螺旋结构并具有较好的纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法
本专利技术属于未变性天然胶原的制备方法领域，具体涉及一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法。
技术介绍
制革原材料——生皮的主要成分胶原是一种非常热门的天然高分子材料。胶原分子由三条左旋的α-链组成，它们以同一轴为中心、右手螺旋方式相互缠绕形成胶原分子特有的右手三股螺旋结构，而这种特殊的三股螺旋结构赋予了胶原优异的生物学功能：低抗原性、良好的生物相容性、凝血作用、促进细胞的增殖生长。基于这些性质，胶原才能够广泛应用于组织工程、药物控释、美容护肤等领域。因此实际应用中都需以保证胶原三股螺旋结构的完整性为前提，若其结构被破坏，会完全丧失其生物活性，随之失去所具有的独特生物学性能。例如，明胶或胶原蛋白水解物，虽然其氨基酸组成与胶原无明显区别，也具有无毒无污染、可生物降解性的优点，但是由于其多肽链呈无规卷曲结构而非三股螺旋构象，物化性质与胶原不尽相同且不具有生物活性。因此，在实际应用中，制备具有三股螺旋结构的未变性胶原是发挥其生物学价值的前提。胶原主要存在于皮肤、软骨、跟腱等结缔组织中。目前，提取胶原所用的原材料主要是猪皮(M.T.Sheuetal.Characterizationofcollagengelsolutionsandcollagenmatricesforcellculture.Biomaterials.22(2001),1713-1719)、牛皮(PreethiL.Chandranetal.StructuralMechanismforAlterationofCollagenGelMechanicsbyGlutaraldehydeCrosslinking.ConnectiveTissueResearch.53(2012),285-297)、牛跟腱(F.Wolfgangetal.Effectofprocessingconditionsontherheologicalbehaviorofcollagendispersions.EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics.51(2001),259-265)和鼠尾(R.Ushaetal.Structureandconformationofintramolecularlycross-linkedcollagen.ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces.41(2005),21-24)。在这四种原料中，牛皮和猪皮产量是最大的，提取量最多；此外，从哺乳动物皮提取的胶原具有较好的耐酶、耐热稳定性和机械性能，因此哺乳动物皮仍是目前胶原制备的主要原材料。针对皮胶原的提取采用的原材料有鲜皮以及制革过程的中间物灰碱皮。其中，鲜皮需经刮毛、去肉、脱毛、脱脂、脱色等预处理去除非胶原成分，操作工序复杂、提取时间较长(付强,李国英,许燕.天然胶原高提取率的皮预处理方法的研究[J].中国皮革2006,(1):28-31,35.)；灰碱皮提取胶原需要先进行脱灰脱钙处理，对钙残留量要求较高，且灰碱皮本身无法长期储存(四川大学.一种从制革废皮边角料中提取未变性天然胶原的方法:CN200710300903.1.2008-05-28李东,李国英,姜德云等.从制革废灰碱牛皮中提取天然胶原(I)-预处理和提取工艺.中国皮革,2008,(9):8-11.)；而对于制革过程的另一中间物——浸酸皮，只需中和后便可提取胶原，提取工艺简单、需时较短且浸酸皮便于保存。相比之下，从浸酸皮中提取胶原是一种相对便捷的方案。国内外尚缺乏关于从浸酸皮中提取胶原的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法。该方法选用制革过程的中间物-浸酸皮为原料，通过预处理、提取和纯化后制得未变性天然胶原。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，包括以下步骤：S1、原料预处理将浸酸皮加入至氯化钠溶液中，搅拌的过程中加入弱碱以调整pH值至5.5～6.5，取出并清洗皮块，剪碎后备用，得到预处理后的皮块；S2、未变性天然胶原的提取将S1预处理后的皮块加入至含有蛋白酶的醋酸溶液中，搅拌后获得混合液；S3、未变性天然胶原的纯化(1)离心处理S2制得的混合液，得到上清液后加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物；将沉淀物溶解于醋酸溶液中制得胶原粗溶液；(2)在胶原粗溶液中加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中，制得胶原溶液；(3)将步骤(2)重复0～2次；(4)离心分离最后一次的胶原溶液，得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中进行透析，透析后得到纯化后的未变性天然胶原溶液；(5)冷冻干燥未变性天然胶原溶液后制得未变性天然胶原海绵。本专利技术的进一步改进在于：优选的，S1中，氯化钠溶液的质量浓度为6～10％；浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：(2～10)L；搅拌温度＜25℃。优选的，S1中，弱碱选用碳酸氢钠、碳酸钠或醋酸钠中的至少一种。优选的，S2中，含有蛋白酶的醋酸溶液的制备过程为，将预处理后皮块皮重的1～10％的蛋白酶加入至0.1～2mol/L醋酸溶液中；搅拌时间为48～72h，搅拌温度＜10℃。优选的，S2中，蛋白酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶或真菌复合酶中的任一种或两种复配制得。优选的，S3的步骤(1)中，加入盐使其在上清液中的浓度为0.7～3mol/L；沉淀物溶解于浓度为0.1～1mol/L的醋酸溶液中。优选的，S3的步骤(2)中，加入盐使其在溶液中的浓度0.7～3mol/L；沉淀物溶解于浓度为0.1～1mol/L的醋酸溶液中。优选的，S3的步骤(4)中，沉淀物溶解在浓度为0.01～1mol/L的醋酸溶液中进行透析，透析液为0.01～1mol/L的醋酸溶液，透析时间为3～5天；透析过程中，每7～9小时更换一次透析液。优选的，其特征在于，S3中，盐为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁中的任一种。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，该方法选用制革过程的中间物——浸酸皮为原料并进行简单的中和预处理，提取阶段以醋酸-蛋白酶浸提得到酶溶胶原，纯化阶段利用高速离心和多次盐析除杂，最后透析除盐、冻干得到海绵状胶原，干重提取率＞25％，提取出的产品纯度高，品质优良。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示胶原含有一条β链和两条α链，保留有完整的三股螺旋结构，分子量分别约为20万和10万，无其他杂蛋白条带，表明所得到的胶原保留了典型的三股螺旋结构并具有较好的纯度。此外，采用红外图谱分析样品结构的结果显示样品具有典型的胶原特征吸收峰：酰胺I、II、III带。提取过程中除特殊说明外操作温度均在10℃以下，得到的产品溶液透明澄清、冻干海绵色白，易于保存且储存时间长，整个处理方法简单，提取周期较短。进一步的，通过酸酶结合法提取胶原中的蛋白酶能够为胃蛋白酶、酸性蛋白酶或真菌复合酶中的任一种或两种复配制得。这三类酶可作用于胶原分子的非螺旋区域，切断端肽保留胶原分子的三股螺旋区域，一方面使得胶原分子从胶原纤维中脱离出来，另一方面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、原料预处理，将浸酸皮加入至氯化钠溶液中，搅拌的过程中加入弱碱以调整pH值至5.5～6.5，取出并清洗皮块，剪碎后备用，得到预处理后的皮块；S2、未变性天然胶原的提取，将S1预处理后的皮块加入至含有蛋白酶的醋酸溶液中，搅拌后获得混合液；S3、未变性天然胶原的纯化，(1)离心处理S2制得的混合液，得到上清液后加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物；将沉淀物溶解于醋酸溶液中制得胶原粗溶液；(2)在胶原粗溶液中加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中，制得胶原溶液；(3)将步骤(2)重复0～2次；(4)离心分离最后一次的胶原溶液，得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中进行透析，透析后得到纯化后的未变性天然胶原溶液；(5)冷冻干燥未变性天然胶原溶液后制得未变性天然胶原海绵。

【技术特征摘要】
1.一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、原料预处理，将浸酸皮加入至氯化钠溶液中，搅拌的过程中加入弱碱以调整pH值至5.5～6.5，取出并清洗皮块，剪碎后备用，得到预处理后的皮块；S2、未变性天然胶原的提取，将S1预处理后的皮块加入至含有蛋白酶的醋酸溶液中，搅拌后获得混合液；S3、未变性天然胶原的纯化，(1)离心处理S2制得的混合液，得到上清液后加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物；将沉淀物溶解于醋酸溶液中制得胶原粗溶液；(2)在胶原粗溶液中加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中，制得胶原溶液；(3)将步骤(2)重复0～2次；(4)离心分离最后一次的胶原溶液，得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中进行透析，透析后得到纯化后的未变性天然胶原溶液；(5)冷冻干燥未变性天然胶原溶液后制得未变性天然胶原海绵。2.根据权利要求1所述的一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，其特征在于，S1中，氯化钠溶液的质量浓度为6～10％；浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：(2～10)L；搅拌温度＜25℃。3.根据权利要求1所述的一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，其特征在于，S1中，弱碱选用碳酸氢钠、碳酸钠或醋酸钠中的至少一种。4.根据权利要求1所述的一种从...

【专利技术属性】
技术研发人员：田振华，马建中，吕斌，王浩，程坤，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61