桑黄护肝多糖PPB-2及其制备方法技术

本发明专利技术涉及多糖制备技术领域，公开了桑黄护肝多糖PPB‑2的制备方法，包括桑黄粉脱脂和去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣；桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％NaCl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖；桑黄粗多糖提取液经Sevag法除去蛋白质，经透析后用乙醇沉淀得到预制品；预制品经DEAE‑52离子交换层析柱洗脱后，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖G100层析柱洗脱后，得到桑黄护肝多糖PPB‑2；还公开了该制备方法制备得到的桑黄护肝多糖PPB‑2。本发明专利技术制备得到的桑黄护肝活性多糖PPB‑2，纯度均一，对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用，可用于护肝产品的开发。

【技术实现步骤摘要】
桑黄护肝多糖PPB-2及其制备方法
本专利技术涉及多糖制备
，尤其涉及了桑黄护肝多糖PPB-2及其制备方法。
技术介绍
桑黄主要寄生于桑树、杨树、暴马丁香、松树、白桦等树干上，是一类药用真菌的总称。桑黄作为一种重要药用菌有着非常广泛的药理作用，主要表现在以下几个方面：抗突变作用；增强机体的免疫力；抗肿瘤作用；抗纤维化和脂质过氧化作用。我国是野生药用真菌出口大国，但目前对桑黄菌的研究还处于初步阶段，技术尚未成熟。由于我国有限的桑黄资源被过分采集，导致桑黄野生资源濒临枯竭，难以成为稳定的工业产品来源，远远不能满足市场的需求。因而，利用人工栽培技术来生产桑黄子实体来代替野生桑黄是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径。桑黄子实体一般不能直接食用，或者若直接食用不易达到保健治疗效果，只有将有效成分浓缩或纯化，才能提高其功效。真菌多糖作为一类重要的生物活性物质，国内外对真菌多糖的制备、结构、合成、药理学、临床学等方面做了很多工作，其多方面的生物学活性已经得到了开发和应用，如云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、茯苓多糖等多种真菌制剂已经取得了良好的临床效果。但是，由于目前分离到的大都是一些杂多糖，加之生长环境，提取分离技术的不同造成多糖结构或活性的差异，这都给其进一步的研究带来困难，使在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机制收到了限制。另外，虽然不少真菌多糖已经应用于临床，但由于结构不明确，质量难以控制，造成药效重复性较差，不符合国际规范，因而难于在医药领域占主要地位。因此，真菌多糖的分离纯化和结构分析，是真菌多糖进行研究和开发的基础。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺点，提供了桑黄护肝多糖PPB-2及其制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：桑黄护肝多糖PPB-2的制备方法，包括以下步骤：(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉；(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣；3)桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％NaCl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，桑黄粗多糖提取液用无水乙醇沉淀得到桑黄粗多糖；(4)桑黄粗多糖经Sevag法除去蛋白质，经透析后用乙醇沉淀得到预制品；(5)预制品经DEAE-52离子交换层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖G100层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到桑黄护肝多糖PPB-2；步骤(5)中，预制品经DEAE-52离子交换层析柱洗脱的具体步骤为：预制品用蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，离心，取上清液过0.45μm滤膜，上DEAE-52离子交换层析柱，用蒸馏水、0.1mol/LNaCl水溶液、0.2mol/LNaCl水溶液和0.4mol/LNaCl水溶液以2.0mL/min流速逐级进行梯度洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，-50℃下真空干燥，得到3个多糖组分。作为优选，步骤(2)中脱脂和苷类和生物碱的具体步骤为：桑黄粉中按W:V为1:2加入石油醚，在60℃下回流脱脂1h，重复2次，抽滤；残渣中按W:V为1:5加入体积浓度为90％乙醇在95℃下回流1h，除去苷类和生物碱，重复3次，抽滤，残渣在60℃条件下烘干至恒重，得到桑黄残渣。作为优选，步骤(3)中，桑黄残渣采用微波提取法提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，微波功率为300～500W，微波时间为5～10min。微波提取有助于高分子多糖分解成低分子多糖，同时，既可以增加多糖的溶解度和降低多糖的粘稠度，也有助于增加多糖的活性。作为优选，聚乙二醇400水溶液的体积浓度为20％～40％，含0.1％NaCl的聚乙二醇400水溶液与桑黄残渣的体积质量比为20～40:1。聚乙二醇400是一种绿色，无毒的有机试剂，它能够增加多糖的溶解性，改变溶液的消耗因数，加速微波能量转移，从而大大提高桑黄粗多糖的提取效率；同时，本专利技术在聚乙二醇400水溶液中加入0.1％NaCl作为提取介质，能够促进微波加热和能量的传递，提高桑黄粗多糖的提取效率。作为优选，步骤(4)中，Sevag法除蛋白质的具体步骤为：桑黄粗多糖溶于去离子水配成10mg/mL的溶液，与Sevag试剂混合除去蛋白质10次，减压浓缩除去Sevag试剂，Sevag试剂为体积比为4:1的氯仿和正丁醇。作为优选，步骤(4)中，透析时间为48h，透析所用透析袋的截留量为3000KDa。作为优选，步骤(3)和(4)中，无水乙醇沉淀的具体步骤为：在桑黄粗多糖提取液或透析后的桑黄粗多糖中加入无水乙醇，使乙醇质量浓度达到80％，搅拌后，4℃冰箱中过夜，4000r/min离心15min后，收集沉淀，冷冻干燥后得到桑黄粗多糖或预制品。作为优选，步骤(5)中，第2个组分经葡聚糖G100层析柱洗脱的具体步骤为：取第2个组分用蒸馏水溶液配制成10mg/mL溶液，过0.45μm滤膜，上葡聚糖G100层析柱，用蒸馏水以1.0-1.2mL/min流速洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测后，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，冷冻干燥得到桑黄护肝多糖PPB-2。由上述制备方法制备得到的桑黄护肝多糖PPB-2。作为优选，桑黄护肝多糖PPB-2包括海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，采用多角度激光散射法测定桑黄护肝多糖PPB-2的分子量，得到桑黄护肝多糖PPB-2的数均分子量为1.949×104Da，重均分子量为2.060×104Da，桑黄护肝多糖PPB-2是一种高度聚合的大分子多糖。本专利技术由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本专利技术制备得到的桑黄护肝活性多糖PPB-2，纯度均一，对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用，可用于护肝产品的开发，这对于提升桑黄药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。附图说明图1是本专利技术的桑黄护肝活性多糖PPB-2的单糖组成图，其中，1为木糖，2为阿拉伯糖，3为半乳糖，4为葡萄糖，5为海藻糖，6为甘露糖。图2是本专利技术的桑黄护肝活性多糖PPB-2的分子量分布图。图3是本专利技术的桑黄护肝活性多糖PPB-2的红外光谱图。图4是本专利技术的桑黄护肝活性多糖PPB-2的核磁共振氢谱图。图5是本专利技术的桑黄护肝活性多糖PPB-2的扫描电镜图，其中(a)为放大500倍的多糖扫描电镜图；(b)为放大1000倍的多糖扫描电镜图。图6是实施例1的小鼠肝脏病理切片图，其中：a为空白对照组的小鼠肝脏病理切片图；b为模型对照组的小鼠肝脏病理切片图；c为PPB-2低剂量组的小鼠肝脏病理切片图；d为PPB-2高剂量组的小鼠肝脏病理切片图；e为阳性对照组的小鼠肝脏病理切片图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1桑黄子实体由浙江省杭州市淳安县千岛湖桑都食用菌生产合作社栽培。桑黄护肝多糖PPB-2的制备方法，包括以下步骤：(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉。(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣。步骤(2)中脱脂和苷类和生物碱的具体步骤为：桑黄粉中按W:V为1:2加入石油醚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.桑黄护肝多糖PPB‑2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉；(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣；(3)桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％NaCl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，桑黄粗多糖提取液用无水乙醇沉淀得到桑黄粗多糖；(4)桑黄粗多糖经Sevag法除去蛋白质，经透析后用无水乙醇沉淀得到预制品；(5)预制品经DEAE‑52离子交换层析柱洗脱后，苯酚‑硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖G100层析柱洗脱后，苯酚‑硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到桑黄护肝多糖PPB‑2；步骤(5)中，预制品经DEAE‑52离子交换层析柱洗脱的具体步骤为：预制品用蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，离心，取上清液过0.45μm滤膜，上DEAE‑52离子交换层析柱，用蒸馏水、0.1mol/L NaCl水溶液、0.2mol/L NaCl水溶液和0.4mol/L NaCl水溶液以2.0mL/min流速逐级进行梯度洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚‑硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，‑50℃下真空干燥，得到3个多糖组分。...

【技术特征摘要】
1.桑黄护肝多糖PPB-2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)桑黄子实体于60℃烘干至恒重，超微粉碎后，得到桑黄粉；(2)桑黄粉用石油醚脱脂和体积浓度为90％乙醇去除苷类和生物碱后得到桑黄残渣；(3)桑黄残渣中加入含质量浓度为0.1％NaCl的聚乙二醇400水溶液提取桑黄粗多糖，得到桑黄粗多糖提取液，桑黄粗多糖提取液用无水乙醇沉淀得到桑黄粗多糖；(4)桑黄粗多糖经Sevag法除去蛋白质，经透析后用无水乙醇沉淀得到预制品；(5)预制品经DEAE-52离子交换层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到3个多糖组分，取第2个组分经葡聚糖G100层析柱洗脱后，苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，得到桑黄护肝多糖PPB-2；步骤(5)中，预制品经DEAE-52离子交换层析柱洗脱的具体步骤为：预制品用蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，离心，取上清液过0.45μm滤膜，上DEAE-52离子交换层析柱，用蒸馏水、0.1mol/LNaCl水溶液、0.2mol/LNaCl水溶液和0.4mol/LNaCl水溶液以2.0mL/min流速逐级进行梯度洗脱，洗脱液用自动收集器收集，经苯酚-硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，减压浓缩后，-50℃下真空干燥，得到3个多糖组分。2.根据权利要求1所述的桑黄护肝多糖PPB-2的制备方法，其特征在于：步骤(2)中脱脂和苷类和生物碱的具体步骤为：桑黄粉中按W:V为1:2加入石油醚，在60℃下回流脱脂1h，重复2次，抽滤；残渣中按W:V为1:5加入体积浓度为90％乙醇在95℃下回流1h，除去苷类和生物碱，重复3次，抽滤，残渣在60℃条件下烘干至恒重，得到桑黄残渣。3.根据权利要求1所述的桑黄护肝多糖PPB-2的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：张作法，吕国英，蔡为明，金群力，陈建飞，苗立祥，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33