源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽，其氨基酸序列为Gly‑Trp。该肽具有明显的降血压活性，是一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化的新型的ACE抑制剂，可以用于制备降血压药物或者保健食品。

【技术实现步骤摘要】
源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽及其制备方法
本专利技术属于生物来源活性物质的制备，尤其涉及生物来源的活性物质的提取分离方法。
技术介绍
肽的消化吸收理论的进展证实了机体可直接吸收小分子肽类物质，肽类物质不但可以作为营养的有益补充，有些具有一定序列的肽还具有特殊的生理活性――即生物活性肽。来源于食物蛋白质中的小分子生物活性肽具有如下优势：分子质量小，易于消化吸收，不易引起免疫原性；空间构效关系简单，易于进行活性机理的研究；来源于食物蛋白质，不易引起毒副作用。高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准，延长寿命有着重要的意义。血管紧张素I转换酶(ACE)在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用。ACE可以将血管紧张素I转换为血管紧张素Ⅱ，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。因此抑制ACE活性，能够起到降血压功效。目前市场上治疗高血压的合成物卡普托利就是ACE的抑制剂，但它有很多副作用，所以源于食品蛋白中的ACE抑制肽因其无毒副作用，同时具有其它疗效而被广泛应用，市场前景极好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化的新型ACE抑制肽。基于此，本专利技术首先提供一种源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽，其氨基酸序列为Gly-Trp(GW)。另一方面，本专利技术提供上述源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：(1)预处理：鲽鱼皮去鳞去肉，洗净，剪碎成1cm×1cm的小块，4℃条件下，按料液比1g:10mL加入0.1mol/L的NaOH溶液搅拌24h，每12h更换NaOH溶液(除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素)；然后用4℃水冲洗鱼皮至中性，沥干；(2)经预处理后的鲽鱼皮，按料液比1g:30ml加入0.5mol/L的冰乙酸水溶液，在4℃低速搅拌24h，4℃条件下10000r/min离心15min，取上清液；将未提取彻底的鱼皮再次用等体积的0.5mol/L冰乙酸水溶液提取，取上清液；合并2次提取所得的上清液；加入NaCl溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L；静置过夜后，体系于4℃条件下5000r/min离心20min，弃上清液；所得沉淀溶于0.5mol/L冰乙酸水溶液，8000r/min离心20min除去不溶性杂质；继而经3次盐析后，将沉淀先用0.1mol/L的冰乙酸水溶液透析2天，每12h换一次透析液；再用超纯水进行透析3天，每12h换一次超纯水；最后对经透析处理的溶液进行冷冻干燥，得到酸溶性胶原蛋白(ASC)；(3)将步骤(2)所制备的酸溶性胶原蛋白(ASC)按照2g/100ml的浓度加入至0.05mol/L的磷酸缓冲液中，加入500-2000U/g中性蛋白酶，pH7-7.5和45±2℃条件下搅拌反应8～10h，得到酶解液；(4)对步骤(3)所制备的酶解液，首先分别利用陶瓷膜、3kDa超滤膜、1kDa超滤膜及300Da超滤膜进行逐级分离，取300-1000Da组分进行SephadexLH-20凝胶层析柱分离，流动相为30％的甲醇溶液，流速为0.5mL/min，上样体积为10mL，样品浓度为0.2g/mL，检测波长为280nm；台式纪录仪记录速度为0.2mm/min，电压10mv，电流2安培；采集第58-68管的组分(F7)；(5)采用RP-HPLCHypersilBDSC18对上述步骤(4)所采集的组分(F7)进一步分离，上样体积20μl，上样浓度10mg/mL，流速1mL/min；梯度洗脱：流动相A液：0.1％的TFA水溶液；流动相B液：乙腈；0min：A，100％；B0％；40min：A，0％；B，100％；50min：A，0％；B，100％；检测波长为215nm；监测ACE抑制活性，采集保留时间为39min的组分(F7-17)。上述获得的本专利技术的鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽经检测获知其氨基酸序列，为Gly-Trp。该肽具有明显的降血压活性，是一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化的新型的ACE抑制剂，可以用于制备降血压药物或者保健食品。因此，本专利技术再一方面的目的在于提供所述的活性肽，在制备防治高血压的药物或食品中的应用。附图说明图1是五种蛋白酶媒介产物的ACE抑制活性筛选实验图图2(A)是LH-20凝胶色谱对鱼皮胶原蛋白酶解产物的分离结果图。图2(B)LH-20凝胶色谱分离组分ACE抑制活性效果图。图3组分F7的高效液相色谱图。图4组分F7-17的一级质谱图。图5组分F7-17的二级质谱图。图6鲽鱼皮胶原蛋白肽对SHR大鼠的降血压效果实验结果图。图7鲽鱼皮胶原蛋白肽对SHR大鼠RAS系统相关指标影响实验结果图：其中：a.血清中ACE含量；b.血清中AngII含量；c.血清中血管紧张素原酶(ATG)含量；d.血清中醛固酮(ALD)含量。具体实施方式本专利技术涉及一种源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽，即氨基酸序列为GW活性短肽的制备方法。从鲽鱼皮中制备酸性胶原蛋白，进而对胶原蛋白进行酶解。本专利技术也包括使用中性蛋白酶对鲽鱼皮行酶解的步骤，分离纯化方式及序列确定。对酶解用蛋白酶的筛选在研发的前期进行了详尽的研究。在用于测试的酸溶性胶原蛋白(ASC)中加入酸性蛋白酶(pH3.0和45℃)、碱性蛋白酶(pH10.0和45℃)、中性蛋白酶(pH7.2和45℃)、木瓜蛋白酶(pH6.0和55℃)和胃蛋白酶(pH2.0和37℃)五种蛋白酶对鲽鱼皮进行酶解。每种酶的加酶量为250U/g，酶解时间为1h、3h、5h、7h、9h、12h、24h、36h、48h，料液比为1:40g/mL。酶解完成后灭活，8000rpm离心20min，收集上清液，冷冻干燥，得到粉末状鲽鱼皮胶原蛋白肽。测定其ACE抑制活性，中性蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性最高(如图1)。通过单因素和正交实验，中性蛋白酶酶解鲽鱼皮胶原蛋白的最优条件为：酶解时间9h，加酶量1000U/g，料液比1:32.5g/mL。如无特殊说明，本说明书中述及的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶均为天津市诺奥科技发展有限公司商品酶。本说明书中采用反相高效液相色谱定量ACE与底物反应生成马尿酸的量进行ACE抑制活性测试(BiochemicalPharmacology,1971,20:1637-1648.)。下述非限制性实施例用于对本专利技术做进一步说明，不应被理解为对本
技术实现思路
任意形式的限定。实施例1：鲽鱼皮胶原蛋白的制备鲽鱼皮去鳞去肉，洗净，剪碎成1cm×1cm的小块，4℃条件下，以料液比1:10(g/ml)加入0.1mol/L的NaOH溶液搅拌24h(NaOH溶液每12h更换一次)，除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素，然后用4℃水冲洗鱼皮至中性，沥干，-20℃冷冻保存。取处理后的鲽鱼皮，以料液比1∶30(g/ml)加入0.5mol/L的冰乙酸溶液，在4℃低速搅拌24h，4℃条件下10000r/min离心15min，取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽，其氨基酸序列为Gly‑Trp。

【技术特征摘要】
1.源于鲽鱼皮胶原蛋白的ACE抑制肽，其氨基酸序列为Gly-Trp。2.权利要求1所述的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：(1)预处理：鲽鱼皮去鳞去肉，洗净，剪碎成1cm×1cm的小块，4℃条件下，按料液比1g:10mL加入0.1mol/L的NaOH溶液搅拌24h，每12h更换NaOH溶液；然后用4℃水冲洗鱼皮至中性，沥干；(2)经预处理后的鲽鱼皮，按料液比1g:30ml加入0.5mol/L的冰乙酸水溶液，在4℃低速搅拌24h，4℃条件下10000r/min离心15min，取上清液；将未提取彻底的鱼皮再次用等体积的0.5mol/L冰乙酸水溶液提取，取上清液；合并2次提取所得的上清液；加入NaCl溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L；静置过夜后，体系于4℃条件下5000r/min离心20min，弃上清液；所得沉淀溶于0.5mol/L冰乙酸水溶液，8000r/min离心20min除去不溶性杂质；继而经3次盐析后，将沉淀先用0.1mol/L的冰乙酸水溶液透析2天，每12h换一次透析液；再用超纯水进行透析3天，每12h换一次超纯水；最后对经透析处理的溶液进行冷冻干燥，得到酸溶性胶原蛋白；(3)将步骤(2)所制备的酸溶性胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵慧，胡建恩，卢航，张亚飞，刘锴锴，郝志娜，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21