一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及分离技术领域，公开了一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用，制备方法包括：1)琼脂糖微球的制备；2）环氧化琼脂糖的制备；3）环氧化琼脂糖的氨基化修饰；4）苯硼酸琼脂糖的制备。本发明专利技术制备的基于琼脂糖基的高柱容量高生物相容性硼亲和材料，其中琼脂糖被选作为基架，聚乙烯亚胺作为超支化配基进行修饰，同时3,5‑二氟‑4‑甲酰基苯硼酸作为亲和基团；琼脂糖具有更高的亲和性及柱容量和可操作性。本发明专利技术克服了一系列技术问题，成功将硼亲和材料应用于细胞水平的识别与分离，与现有技术相比，取得了显著的进步。

【技术实现步骤摘要】
一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用
本专利技术涉及分离
，尤其涉及一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用。
技术介绍
由细菌引起的疾病发病率在世界范围内正呈上升趋势，并已成为世界各国一种隐形负担。因此细菌尤其致病菌检测及分析开发具有重要的意义，这就要求需要纯度相对较高的菌体；但是细菌的生长环境比较复杂，尤其是样品中富含蛋白质，脂肪，糖类，无机盐等复杂基质，给细菌分析一个巨大的挑战；此外样品基质种类复杂多样且没有可循规律，这就进一步增加了细菌纯化或者检测难度。如基于聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）对于DNA检测灵敏度可达到15～16ngDNA/mL（<10cfu），但是样品提取过程中残留的磷酸盐、MgCl2，以及食品中原有的胶原，黑色素，亚铁血红素，肌红蛋白和乳铁蛋白等对于PCR检测造成严重影响，造成实际样品检测限偏高（>103cfu）。目前细菌分离纯化的主要方法有免疫磁珠，试剂盒，离心等，但是这些方法通用性较低且仍旧会残留部分基质。因此寻找新型的细菌识别材料并对细菌进行有效分离至关重要。硼亲和材料（BAC）是基于苯硼酸在不同pH环境中结构变化从而特异性结合顺式二羟基团原理发展起来的一种新型亲和材料，在生理及偏碱性环境中可以与顺式邻二羟基可逆的反应形成五元或者六元环酯。从1950年，首次报道硼酸及其化合物会与糖类形成酯类以来，苯硼酸的亲和作用已经越来越受到重视。如今，基于pH可逆以及硼酸化学原理的硼亲和材料已经在亲和色谱领域识别顺式二羟化合物，如糖蛋白，糖肽，儿茶酚类以及核苷类等，毛细管色谱等领域都具有广泛的应用。同时，鉴于细菌细胞壁表面具有多种多样的低聚糖，这些低聚糖可以作为顺式二羟亲和配体，基于此我们可以用细菌特异性抗体或凝集素对细菌进行富集，而硼亲和材料可以类似一种亲和配体与细菌进行可逆性结合。此外鉴于硼亲和材料对于顺式二羟化合物的竞争性结合可以排除很多基质的影响，为细菌的纯化提供了一种理论支撑。而现在基于硼亲和原理对于细菌的富集主要基于传感器及电化学理论，其仍旧受困于后期检测的适应性不足和基质耐受性差的影响。现在硼亲和材料的基架主要有有机聚合整体柱，无机-有机杂化整体柱，表面修饰材料以及磁性纳米材料等，在色谱分析等小分子或蛋白组学领域应用广泛。相比于传统方法有机聚合整体柱和整体柱等追求高效液相色谱性不同，对于细菌的富集分离材料，需要以下几特点：1）高的生物相容性；2）高载量；3）易操作性。而填料的特性主要受到填料基架、填料配基以及偶联技术的影响，其中填料基架是最主要因素。有大量研究报道，硼亲和色谱常用基架如直接聚合材料，有机硅胶杂化整体柱对于糖蛋白有极好的生物相容性及分离能力，但是考虑到细菌结构要更加复杂并且体积大的多；并且这些材料过于紧密的孔隙对于通透性及有效接触面积是个阻碍；此外部分其他的材料也存在生物相容性低的弱点，这就导致现有硼亲和材料对于细菌的识别及富集存在较大缺陷的。自1967年初次被分离之后，因为含有的诸多优点如极好的亲水性和中性，开放的孔结构以及稳定的物理化学性质和化学多功能性等，琼脂糖在大分子分离纯化中受到越来越多的重视。基于这些特性，琼脂糖在微生物分离过程中具有很大的优势，并且表面修饰琼脂糖是一种主要的提高其色谱分离能力的有效方式。已有研究中琼脂糖基硼亲和材料主要应用在小分子中，对于大分子物质其琼脂糖效果以及柱容量等都存在一定不足；而现有研究中为提高硼亲和柱的柱容量及亲和性，不同种类的硼亲和基团修饰方法，如低pKa苯硼酸，高比表面积基架以及多枝化修饰已经被采用，此外“团队亲和”和协同效应也被认为是一种提高亲和柱容量的有效方法。通过超支化基团放大硼亲和基团的方法是一种有效提升亲和力和载量的方法，但是现有研究在小分子及毛细管色谱中应用较多，其在细胞水平的识别与分离应用仍旧不完善的，鉴于硼亲和材料对于亲和是很有必要的，因此发展针对于高亲和力高柱容量的适应性硼亲和材料很有必要。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法及其应用。本专利技术制备的基于琼脂糖基的高柱容量高生物相容性硼亲和材料，其中琼脂糖被选作为基架，聚乙烯亚胺作为超支化配基进行修饰，同时3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸作为亲和基团；琼脂糖具有更高的亲和性及柱容量和可操作性。本专利技术克服了一系列技术问题，成功将硼亲和材料应用于细胞水平的识别与分离，与现有技术相比，取得了显著的进步。本专利技术的具体技术方案为：一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法，包括以下步骤：1)琼脂糖微球的制备。2）环氧化琼脂糖的制备。3）环氧化琼脂糖的氨基化修饰：以5g环氧化琼脂糖计，将5g环氧化琼脂糖与15mL聚乙烯亚胺的乙腈溶液(1:10,v/v)充分混合，55-65℃搅拌反应10-15h，得到氨基化琼脂糖。4）苯硼酸琼脂糖的制备：以0.2g氨基化琼脂糖计，将0.2g氨基化琼脂糖加入到15-25mL重蒸甲醇中，超声后依次加入2.6-2.7mmol的3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和5.3-5.4mmol的氰基硼酸钠，常温搅拌反应70-75h，产物用无水甲醇，NaHCO3溶液，氯化钠溶液和水多次冲洗，真空干燥。本专利技术制备的基于琼脂糖基的高柱容量高生物相容性硼亲和材料，其中琼脂糖被选作为基架，聚乙烯亚胺作为超支化配基进行修饰，同时3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸作为亲和基团；作为对比有机-无机杂化柱进行相同修饰并进行验证表明，琼脂糖具有更高的亲和性及柱容量和可操作性；随后对于琼脂糖基硼亲和材料对其聚合度，亲和基团修饰率等条件以柱容量为指标进行最优化；最后对制备好的亲和材料进行最适pH，离子强度及吸附时间和洗脱时间的评估；最终以饮用水及牛奶样品作为验证净化效果。现有研究中琼脂糖基硼亲和材料主要应用在小分子中，对于大分子物质其琼脂糖效果以及柱容量等都存在一定不足；本专利技术克服了一系列技术问题（详见下文），成功将硼亲和材料应用于细胞水平的识别与分离，与现有技术相比，取得了显著的进步。目前硼亲和材料的基架主要有有机聚合整体柱，无机-有机杂化整体柱，表面修饰材料以及磁性纳米材料等，在色谱分析等小分子或蛋白组学领域应用广泛，其具有高柱效、高比表面积及致密性的特点，这些特点对于非活性物质的高效液相色谱分离及检测效果突出。但是对于细胞水平的富集分离材料所需要克服的问题主要有：1）材料的高的生物相容性以保证亲和过程中细胞不破裂，不死亡；2）材料的高载量，细胞远大于蛋白等分子，其载量的高低对于亲和材料的使用效果影响较大；3）材料的高通透性，亲和材料富集过程不易被细菌细胞堵塞。而填料的特性主要受到填料基架、填料配基以及偶联技术的影响，其中填料基架是最主要因素，而目前硼亲和色谱常用基架如直接聚合材料，有机硅胶杂化整体柱对于糖蛋白有极好的富集分离能力，但是考虑到细菌结构要更加复杂并且体积大的多；并且这些材料过于紧密的孔隙对于通透性及有效接触面积是个极大阻碍，此外现有的材料也存在生物相容性低的弱点，这就导致现有硼亲和材料对于细胞的识别及富集会出现细胞死亡、阻塞及低容量的缺陷。本专利技术选用琼脂糖基架作为提高生物相容性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1) 琼脂糖微球的制备；2）环氧化琼脂糖的制备；3）环氧化琼脂糖的氨基化修饰：以5g环氧化琼脂糖计，将5g环氧化琼脂糖与15 mL体积浓度为5‑15%的聚乙烯亚胺的乙腈溶液充分混合，55‑65℃搅拌反应10‑15h，得到氨基化琼脂糖；4）苯硼酸琼脂糖的制备：以0.2 g氨基化琼脂糖计，将0.2g氨基化琼脂糖加入到15‑25mL重蒸甲醇中，超声后依次加入2.6‑2.7mmol的3,5‑二氟‑4‑甲酰基苯硼酸和5.3‑5.4mmol的氰基硼酸钠，常温搅拌反应70‑75h，产物用无水甲醇，NaHCO3溶液，氯化钠溶液和水多次冲洗，真空干燥。

【技术特征摘要】
1.一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)琼脂糖微球的制备；2）环氧化琼脂糖的制备；3）环氧化琼脂糖的氨基化修饰：以5g环氧化琼脂糖计，将5g环氧化琼脂糖与15mL体积浓度为5-15%的聚乙烯亚胺的乙腈溶液充分混合，55-65℃搅拌反应10-15h，得到氨基化琼脂糖；4）苯硼酸琼脂糖的制备：以0.2g氨基化琼脂糖计，将0.2g氨基化琼脂糖加入到15-25mL重蒸甲醇中，超声后依次加入2.6-2.7mmol的3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和5.3-5.4mmol的氰基硼酸钠，常温搅拌反应70-75h，产物用无水甲醇，NaHCO3溶液，氯化钠溶液和水多次冲洗，真空干燥。2.如权利要求1所述的一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法，其特征在于，步骤1）中，琼脂糖微球的制备方法如下：以0.5g琼脂糖干粉计，将0.5g琼脂糖干粉溶于10-20mL水中，搅拌煮沸为透明凝胶状，混匀作为水相；将3-5gSpan80加入到100mL液体石蜡中，75-85℃恒温混匀后作为油相；在搅拌下将水相滴加到油相中，随后持续搅拌后冷却至室温，再持续搅拌使微球成形；制得的微球用石油醚和异丙醇的混合洗涤液洗涤，再分别用石油醚和水清洗，得到琼脂糖微球。3.如权利要求2所述的一种聚乙烯亚胺超支化琼脂糖基硼亲和材料的制备方法，其特征在于，步骤1）中，水相滴加到油相过程中搅拌速率为800-900rpm，随后以200-300rpm持续搅拌8-12min后冷却至室温，再持续搅拌2-8min使微球成形。4.如权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹立民，郑洪伟，林洪，隋建新，王博成，殷佳珞，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37