一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法技术

本发明专利技术公开了一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，在精、卵结合后的适当时机，选取一定的时间区间对受精卵进行一定强度的静水压处理，然后再恢复到正常的环境下进行常规孵化，使本应育成二倍体的受精卵，经静水压处理后生成100％的三倍体受精卵，再由三倍体受精卵育成三倍体苗种。本发明专利技术的有益效果是建立的虹鳟三倍体制种技术方法可高效、批量化诱导产生三倍体虹鳟鱼苗，虹鳟三倍体的诱导率高达100％，存活率与二倍体虹鳟无显著性差异。本发明专利技术的方法操作简单、实用性强、易行、安全可靠，为虹鳟三倍体的规模化生产提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法
本专利技术属于鱼类多倍体育种
，涉及一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，通过建立静水压法诱导受精卵染色体组加倍大量生产虹鳟三倍体鱼苗的技术方法，确定最佳的诱导条件，达到产业化生产不育三倍体的目的，以弥补现有技术的不足。
技术介绍
虹鳟(Onchorynchusmykiss)隶属鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Onchorynchus)，因其性成熟个体体侧有一条宽而鲜艳的彩虹带而得名，英文名为rainbowtrout，原产于北美地区，为典型的冷水性鱼类，是世界性重要经济养殖鱼类之一和水产遗传育种领域的重要研究对象。我国1959年开始引进和养殖虹鳟，由于长期的近亲繁殖以及缺乏系统的选育，导致养殖个体出现了性早熟、个体小型化、病害频发等问题，特别是近年来受进口大规格三文鱼的影响，小规格鲑鳟鱼在中国的市场价位很低，养鳟者只能进口不育的、大个体的全雌三倍体虹鳟发眼卵进行养殖以满足市场要求，因为我们目前不具备规模化生产全雌三倍体虹鳟的能力。可见，全雌三倍体虹鳟卵的规模化生产已成为虹鳟养殖业的瓶颈。三倍体虹鳟雌性个体完全不育，避免了因性腺发育造成鱼体生长性能与肉质降低的风险，养殖效益较高；同时，不育的三倍体虹鳟逃逸到自然水域中不会形成种群，可以维持渔业生态环境的稳定，同时避免性腺成熟个体常有的死亡现象，具有市场与生态双重效益。目前，常用的鱼类多倍体诱导方法包括直接法，即采用生物法、物理法和化学法直接诱导三倍体鱼类，其中物理方法中的温度休克法和静水压法最为常用；间接法是指四倍体与二倍体杂交生产三倍体诱导方法，间接法要求获得一定数量的四倍体虹鳟群体，有相关研究表明，四倍体杂交后代的存活率不高，因此无法持续稳定地进行大规模地虹鳟三倍体生产。基于大量报道，在直接法诱导虹鳟三倍体中我国采用最多的为温度休克法，温度处理比较简便，无需专门设备，但国内研究最高的三倍体虹鳟诱导率为80％，无法成功实现100％的诱导率，并且热休克处理并不稳定，对受精卵的损伤较大，以致存活率不高，与热休克法相比，静水压法对受精卵的刺激相对较小，处理时间较短，也更加稳定，效果优于热休克。然而，目前我国仍然没有形成较为成熟的虹鳟多倍体诱导技术体系。因此，基于上述的问题，本专利技术提供一种三倍体虹鳟制种技术方法，通过静水压法提高三倍体虹鳟诱导率、存活率，并建立我国自己成熟稳定的多倍体虹鳟优质苗种生产体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，本专利技术要解决的技术问题包括：1硬骨鱼类卵母细胞在第二次减数分裂中期受精，此时第二极体并未排放，受精卵拥有来自母本的两套染色体与父本的一套染色体，共计三套染色体。三倍体诱导的核心是利用外界理化因子干扰受精卵第二极体的排放，并保证受精卵正常的卵裂、发眼与破膜孵化。若静水压处理于第二极体排放之后，则无法得到三倍体受精卵。因此，三倍体虹鳟诱导的关键技术是确定抑制虹鳟受精卵第二极体释放的最佳时间点，即对受精卵施加静水压处理的最优起始时间。2在确定最优起始时间之后，再通过单因子和正交实验法对静水压大小、持续时间等参数进行摸索和优化，静水压大小与持续时间等参数直接决定着诱导强度的大小。若诱导强度较小，无法达到抑制第二极体释放的目的，进而诱导率会降低；若诱导强度过大，对受精卵会造成一定的损伤，影响后续正常的胚胎发育过程，存活率降低。因此，需要确立合适的诱导强度(静水压大小、持续时间)，保证能够在抑制第二极体排放的同时，不对受精卵的进一步发育造成伤害。本专利技术所采用的技术方案是在精、卵结合后的适当时机，选取一定的时间区间对受精卵进行一定强度的静水压处理，然后再恢复到正常的环境下进行常规孵化，使本应育成二倍体的受精卵，经静水压处理后生成100％的三倍体受精卵，再由三倍体受精卵育成三倍体苗种。本专利技术的三个关键性技术参数：参数(1)、静水压处理的起始时间：在10.5℃水温下，人工授精后20～40分钟开始对受精卵进行静水压处理。参数(2)、静水压大小：65～68.9kg/cm2。参数(3)、静水压处理持续时间：5分钟。虹鳟三倍体制种技术方法，包括以下步骤：步骤1，对雌、雄虹鳟分别进行人工采卵、采精，将卵子采集到盛有单盐等渗液的塑料盆中，精液采集到干燥的塑料盆中，使用雌、雄亲鱼数量比例为2:1；步骤2，人工授精，将精液倒入到盛有卵子的塑料盆中，用羽毛轻轻搅拌15～20秒使精卵混合均匀，并开始计时，作为受精的起点；步骤3，静置3～5分钟充分受精后，加少许清水多次洗卵，洗卵过程中尽可能去除过量的精液、未受精的死卵和血块等杂物；步骤4，对受精卵实施10.5℃冷流水吸水膨胀20～40分钟；步骤5，实施梯度升压法，即将受精卵倒入自制的带有透水网眼的塑料小桶内，提前一分钟放入盛有清水的加压室内，每加压10kg/cm2，暂停10秒，以减缓压力的迅速增加对受精卵造成的损伤；步骤6，实施65～68.9kg/cm2的压力大小、持续时间5分钟，阻止第二极体的排放，诱导产生三倍体受精卵；步骤7，实施梯度降压，即每降压10kg/cm2，暂停10秒，以减缓压力的迅速降低对受精卵造成的损伤；步骤8，实施冷流水10.5℃孵化至孵化积温达220度日，胚胎出现黑色眼点，在此期间孵化室内进行遮光处理，保证受精卵在孵化阶段所需要的暗光条件，并减少对卵的震动，每周使用甲基蓝对受精卵进行杀菌处理；步骤9，实施冷流水10℃至孵化积温达600度日仔鱼孵化出膜；步骤10，在流水环境下对初浮仔鱼实施开食驯饲30天，育成三倍体稚鱼。其中，静水压诱导虹鳟三倍体的三个关键性参数确定过程如下：首先，选择在68.9kg/cm2的压力大小、持续5分钟的诱导强度下，进行起始时间的确定，起始时间选择在10～30分钟范围，每2.5分钟一个实验梯度，统计发眼率、上浮率、三倍体率。结果表明，随着起始时间的延长，各组发眼率、上浮率呈上升趋势，在30分钟组达到最高。起始时间在20～30分钟的范围内各组三倍体率近似为100％。综合发眼率、上浮率、三倍体率三个数据，最佳的三倍体诱导起始时间为受精后的30分钟，在该实验条件下，发眼率为87％，三倍体率为100％。其次，选择在65kg/cm2的压力大小、持续5分钟的诱导强度下，进行起始时间的确定，起始时间选择在10～40分钟范围内，每2.5分钟一个实验梯度，统计发眼率、上浮率、三倍体率。结果表明，在起始时间30～35分钟范围内，各组发眼率与上浮率达到最高，去除起始时间27.5分钟处理组，起始时间20～40分钟内都能够获得近似100％三倍体诱导率。综合发眼率、上浮率、三倍体率三个数据，最优的三倍体诱导起始时间为受精后的30～35分钟。最后，选择受精后的不同时间(20、30、40分钟)，对虹鳟受精卵施加(60、65、70kg/cm2)压力大小，持续时间设定为(3、5、7分钟)，统计发眼率、上浮率和三倍体率。发现各组都能够获得100％三倍体诱导率，但是存活率受起始时间和压力大小的影响显著。起始时间30、40分钟的存活率无明显差异，并且优于20分钟；65、70kg/cm2的发眼率无明显差异，但是子代存活率明显低于60kg/cm2。综上，虹鳟三倍体鱼苗的最佳诱导条件是在受本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，其特征在于：在虹鳟精、卵结合后的适当时机，选取一定的时间区间对受精卵进行一定强度的静水压处理，然后再恢复到正常的环境下进行常规孵化，使本应育成二倍体的受精卵，经静水压处理后生成100％的三倍体受精卵，再由三倍体受精卵育成三倍体苗种。

【技术特征摘要】
1.一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，其特征在于：在虹鳟精、卵结合后的适当时机，选取一定的时间区间对受精卵进行一定强度的静水压处理，然后再恢复到正常的环境下进行常规孵化，使本应育成二倍体的受精卵，经静水压处理后生成100％的三倍体受精卵，再由三倍体受精卵育成三倍体苗种。2.按照权利要求1所述一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，其特征在于：所述静水压处理的起始时间：在10.5℃水温下，人工授精后20～40分钟开始对受精卵进行静水压处理、静水压大小：65～68.9kg/cm2、静水压处理持续时间：5分钟。3.按照权利要求1所述一种静水压诱导虹鳟三倍体的制种方法，其特征在于：所述三倍体制种技术方法，包括以下步骤：步骤1，对雌、雄虹鳟分别进行人工采卵、采精，将卵子采集到盛有单盐等渗液的塑料盆中，精液采集到干燥的塑料盆中，使用雌、雄亲鱼数量比例为2:1；步骤2，人工授精，将精液倒入到盛有卵子的塑料盆中，用羽毛轻轻搅拌15～20秒使精卵混合均匀，并开始计时，作为受精的起点；步骤3，静置3～5分钟充分受精后，加少许清水多次洗卵，洗卵过程中尽可能去除过量的精液、未受精的死卵和血块等杂物；步骤4，对受精卵实施10.5℃冷流水吸水膨胀20～40分钟；步骤5，实施梯度升压法，即将受精卵倒入自制的带有透水网眼的塑料小桶内，提前一分钟放...

【专利技术属性】
技术研发人员：温海深，陈落落，车德钊，李吉方，辛苑茹，张美昭，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37