鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术是一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒其组成为：反应液A，其组成包含：反应缓冲液20%；dNTPs4%；氯化镁水溶液16%；Taq DNA聚合酶2%；去离子水58%；反应液B，其组成为：ISKNV‑mcp‑F和ISKNV‑mcp‑R各占50%；反应液C，Ah‑alt‑F和Ah‑alt‑R各占50%。本发明专利技术还公开了该试剂盒进行检测的方法。本发明专利技术试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，能够一次性同步检测2种病原。解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，能较好满足目前对鳜鱼虹彩病毒病及嗜水气单胞菌引起的败血症共感染一次性检测的迫切需要。

Simultaneous Detection Kit and Detection Method for Siniperca Iridovirus and Aeromonas hydrophila

The present invention is a simultaneous detection kit for Mandarin eel iridovirus and Aeromonas hydrophila. The kit consists of reaction solution A, which consists of 20% reaction buffer solution, 4% dNTPs, 16% magnesium chloride solution, 2% Taq DNA polymerase, 58% deionized water, and reaction solution B, which consists of ISKNV MCP F and ISKNV MCP R, 50% respectively, and reaction solution C, A H F and A h R ALT 50% respectively. The invention also discloses a method for detecting the kit. The kit has strong specificity, high sensitivity, high speed, low cost, simpler operation method, and can simultaneously detect two pathogens at one time. It solves the defects of long time, heavy workload, cross-contamination and complex operation of the existing technology, and satisfies the urgent need of one-time detection of septicemia caused by iridovirus disease of eel and Aeromonas hydrophila.

【技术实现步骤摘要】
鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种鱼类病毒和细菌同步检测的试剂盒，特别是一种用于鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌的同步PCR快速检测试剂盒；本专利技术还涉及一种应用前述试剂盒进行检测的方法。
技术介绍
鳜鱼是我国传统的名贵鱼类，随着养殖集约化程度的增高，养殖密度的增大以及养殖水环境的恶化，鳜鱼的病害问题日益突出，目前已成为威胁我国鳜鱼养殖业健康发展的主要因素。这些病害中，“传染性脾肾坏死病”（又称虹彩病毒病）及细菌引起的败血症等病害危害最为严重，已经造成重大经济损失。鳜鱼的“虹彩病毒病”在农业部1125号公告里被列为二类动物疫病，其病原为虹彩病毒（redseabreamiridovirus），患病鱼典型症状眼球突出，头部充血，尤其是口腔周围、眼、鳍基充血明显，鳃贫血而呈白色、粉红色或呈花斑状，解剖可见肝脏肿大发黄甚至发白或有许多出血点，肾脏、脾脏是病毒感染的主要器官；鳜鱼细菌性败血症病原主要为嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila），患病鱼典型症状下颌、鳃盖、眼、肛门周围和鳍条基部出现点状和块状的轻度出血，胃和肠壁有出血点、无食物，胆囊肿大，腹腔内结缔组织或脂肪充血，腹腔内有较多腹水，肠道内容物稀薄并充有气体。目前养殖生产中常常是“虹彩病毒”和“嗜水气单胞菌”共感染，对鳜鱼养殖造成了巨大的经济损失。严重制约了鳜鱼养殖业的发展。“虹彩病毒”和“嗜水气单胞菌”共感染情况传统的检验方法包括电子显微镜、光学显微镜、形态学检测、生理生化特征检测等，这些检测手段不仅工作量大，而且耗时长，已远远不能满足水产养殖生产上的诊断要求，基于虹彩病毒的mcp基因和嗜水气单胞菌的alt基因同步PCR检测，具有特异性强、灵敏度高和检测耗时短的优点，是同步快速检测鳜鱼虹彩病毒病和嗜水气单胞菌引起的败血症的有效方法，为鳜鱼疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的用于鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌快速检测试剂盒，其灵敏度高、特异性强、操作简便，在鳜鱼处于带毒带菌状态或大规模爆发疾病之前能进行准确的检测。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种应用前述试剂盒进行检测的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种用于鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌快速检测试剂盒,其特点是，其组成为：水14.4μL；10×PCR缓冲液2μL；25mmol/LMgCl21.6μL；200mmol/L4×dNTP混合物0.4μL；引物各0.2μL；5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μL；模板DNA1μL；反应液A，1支，其体积百分比组成为：①反应缓冲液，20%；②dNTPs，4%，浓度为200mM/L；③氯化镁水溶液，16%，浓度为25mM；④TaqDNA聚合酶，2%，浓度为5U/μL；⑤去离子水，58%；反应液B：反应引物1，1支；其体积百分比组成为：ISKNV-mcp-F，50%，浓度为10uM；ISKNV-mcp-R，50%，浓度为10uM；ISKNV-mcp-F为：TGACCAGCGAGTTCCTTGACISKNV-mcp-R为：ATGCTGGGCGCAAAGTAGTA反应液C：反应引物2，1支；其体积百分比组成为：Ah-alt-F，50%，浓度为10uM；Ah-alt-R，50%，浓度为10uM；Ah-alt-F为：TTCGCTGCGACAGCAGACTTAh-alt-R为：TGTACCTTGACGCCAGCCACG鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样，1支；健康鳜鱼组织总DNA的阴性对照试样，1支；超纯水，1支。本专利技术还提供了一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步快速检测方法，其特点是，该方法使用了以上技术方案所述的试剂盒；其步骤如下：（1）DNA抽提：①取发病鳜鱼肝组织样品增菌液1mL，12000r/min离心1min，弃上清，将菌体悬浮于100μL的灭菌蒸馏水中，100℃煮沸10min，冰浴中冷却后12000r/min离心10min，取上清作为PCR模板DNA1；②取发病鳜鱼肝组织，置于无菌的1.5ml的离心管中，加入100µlLB2和20µlProteinaseK55℃孵育3h，使组织完全裂解。12000×g离心5min，取上清，加500µlBB2混匀孵育10min，然后将全部溶液加入离心柱中，12000×g离心30s，弃流出液；加入500µlCB2，12000×g离心30s，弃流出液，重复一次；加入500µlWB2，12000×g离心30s，弃流出液，重复一次，离心2min，彻底去除WB2；将离心柱置于干净的离心管中，加80µl预热的EB（60℃-70℃），室温静置1min，12000×g离心1min，流出液即为所提的模版DNA2；③将模板DNA1和DNA2按1:1混合作为实验总DNA。（2）PCR扩增：向反应管中加入反应液A10μL，反应液B1μL，反应液C1μL，超纯水6μL，模板DNA2μL；PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸30s，34次循环；72℃延伸7min；4℃保温；同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样；（3）琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，扩增出730bp和370bp两条扩增条带的为鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌阳性，无扩增条带的为阴性。本专利技术所述的鳜鱼虹彩病毒RSIV-YZ已经在公开文献《Theinfectionofredseabreamiridovirusinmandarinfish(Sinipercachuatsi)andthehostimmunerelatedgeneexpressionprofiles》中所公开（虹彩病毒RSIV-YZ），上述公开文献发表于《FishandShellfishImmunology》，2018，74：474-484。本专利技术所述的鳜鱼病原嗜水气单胞菌G3菌株已经在公开文献《翘嘴鳜病原嗜水气单胞菌分子特征及LAMP检测方法的建立》中所公开（菌株G3），上述公开文献发表于《水生生物学报》，2017，41（6）：1225-1231。菌株G3在Genebank中16SrRNA基因登录号为KX822740，gyrB基因登录号为KX822741。该毒株RSIV-YZ和菌株G3为公知公用材料，扬州大学动物科学与技术学院水产动物病害实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，扬州大学动物科学与技术学院水产动物病害实验室可对外发放。本专利技术以编码虹彩病毒的mcp基因和嗜水气单胞菌的alt基因为靶基因设计并合成ISKNV-mcp-F和ISKNV-mcp-R、Ah-alt-F和Ah-alt-R2对引物，研制了快速检测试剂盒。使用本专利技术试剂盒进行虹彩病毒和嗜水气单胞菌的同步检测，能显著提高其准确性和特异性，且操作简单，耗时短，费用低廉，为虹彩病毒和嗜水气单胞菌共感染引起的疾病的快速诊断、分子流行病学调查及水产品安全检测等提供了有效方法。本专利技术检测方法通过对样品中DNA提取、PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：水                         14.4 μL；10×PCR缓冲液              2 μL；25mmol/L MgCl2             1.6 μL；200mmol/L 4×dNTP混合物    0.4μL；引物                       各0.2 μL；5U/μl的Taq DNA聚合酶       0.2 μL；模板DNA                    1μL；反应液A，1支，其体积百分比组成为：①反应缓冲液，20%；②dNTPs，4%，浓度为200mM/L；③氯化镁水溶液，16%，浓度为25mM；④Taq DNA聚合酶，2%，浓度为5U/μL；⑤去离子水，58%；反应液B：反应引物1，1支；其体积百分比组成为：ISKNV‑mcp‑F， 50%，浓度为10uM；ISKNV‑mcp‑R，50%，浓度为10 uM；ISKNV‑mcp‑F为：TGACCAGCGAGTTCCTTGACISKNV‑mcp‑R为：ATGCTGGGCGCAAAGTAGTA反应液C：反应引物2，1支；其体积百分比组成为：Ah‑alt‑F，50%，浓度为10uM；Ah‑alt‑R，50%，浓度为10 uM；Ah‑alt‑F为：TTCGCTGCGACAGCAGACTTAh‑alt‑R为：TGTACCTTGACGCCAGCCACG鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样，1支；健康鳜鱼组织总DNA的阴性对照试样，1支；超纯水，1支。...

【技术特征摘要】
1.一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：水14.4μL；10×PCR缓冲液2μL；25mmol/LMgCl21.6μL；200mmol/L4×dNTP混合物0.4μL；引物各0.2μL；5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μL；模板DNA1μL；反应液A，1支，其体积百分比组成为：①反应缓冲液，20%；②dNTPs，4%，浓度为200mM/L；③氯化镁水溶液，16%，浓度为25mM；④TaqDNA聚合酶，2%，浓度为5U/μL；⑤去离子水，58%；反应液B：反应引物1，1支；其体积百分比组成为：ISKNV-mcp-F，50%，浓度为10uM；ISKNV-mcp-R，50%，浓度为10uM；ISKNV-mcp-F为：TGACCAGCGAGTTCCTTGACISKNV-mcp-R为：ATGCTGGGCGCAAAGTAGTA反应液C：反应引物2，1支；其体积百分比组成为：Ah-alt-F，50%，浓度为10uM；Ah-alt-R，50%，浓度为10uM；Ah-alt-F为：TTCGCTGCGACAGCAGACTTAh-alt-R为：TGTACCTTGACGCCAGCCACG鳜鱼虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合基因组DNA的阳性对照试样，1支；健康鳜鱼组织总DNA的阴性对照试样，1支；超纯水，1支。2.一种鳜鱼虹彩病毒与嗜水气单胞菌同步检测方法，其特征在于，该方法使用权利要求1所述的试剂盒；其步骤如下：（1）DNA抽提：①取发病鳜鱼肝组织样品增菌液1mL，12000r/min离心1min，弃上...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓君，刘晓丹，高晓建，陈楠，杨辉，李席席，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32