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用于鉴别三种孢子丝菌的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒制造技术

技术编号:20124619 阅读:45 留言:0更新日期:2019-01-16 13:25
本发明专利技术提供了用于鉴别三种孢子丝菌的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒。通过对球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌的基因组进行比对,筛选得到用于鉴别三种孢子丝菌的靶序列以及针对该靶序列的多重荧光PCR引物和探针,其序列如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑5所示。相对于传统三重荧光PCR检测体系,本发明专利技术节省了4条扩增引物,有效降低体系中引物探针交叉干扰,提升扩增效率,节约检测成本。本发明专利技术检测试剂盒检测球形孢子丝菌和申克孢子丝菌灵敏度可低至10copies,对常见其他真菌和表皮常见细菌均无非特异扩增,具有检测准确,灵敏度高、特异性强,简便快速的优点,具有良好的标本检测能力。

Fluorescent PCR primers, probes and detection kits for identification of three sporotrichosis species

The invention provides fluorescent PCR primers, probes and detection kits for identifying three sporotrichosis species. By comparing the genomes of Sporothrix globosa, Sporothrix schenckii and Sporothrix brasiliensis, the target sequences for identifying three species of Sporothrix and the multiplex fluorescent PCR primers and probes for the target sequences were screened, as shown in SEQ ID NO.1_2 and SEQ ID NO.3_5. Compared with the traditional triple fluorescent PCR detection system, the invention saves four amplified primers, effectively reduces the cross interference of primer probes in the system, improves the amplification efficiency and saves the detection cost. The sensitivity of the detection kit for Sporothrix globosa and Sporothrix schenckii can be as low as 10 copies, and there is no non-specific amplification for other common fungi and epidermal common bacteria. The detection kit has the advantages of accurate detection, high sensitivity, strong specificity, simple and fast, and has good sample detection ability.

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别三种孢子丝菌的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域,特别是涉及用于鉴别球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌的多重荧光定量PCR引物和探针,本专利技术还涉及利用该引物和探针进行球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌检测的方法和试剂盒。
技术介绍
孢子丝菌病(Sporotrichosis)是由双相真菌申克孢子丝菌复合体(Sporothrixschenckiicomplex)侵犯皮肤及皮下组织引起的慢性感染性疾病。病程长,皮损可固定于局部,或延淋巴管走行,严重者可通过血行系统播散,引起内脏器官的感染,也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人们对申克孢子丝菌认识有限,认为其为单一物种。随着基因组学以及分子检测手段的不断发展,发现申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体,其中球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)是临床感染中最常见的致病菌,其余孢子丝菌多为环境菌株,对人基本不致病。球形孢子丝菌在我国主要分布在东北地区,尤其是吉林省,是孢子丝菌病的高发地区。申克孢子丝菌遍布全球,巴西孢子丝菌主要分布于巴西,国内少见报道。研究表明,孢子丝菌不同亲缘种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异,因此在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中,对病原菌鉴定到种是十分必要的。由于局部皮损真菌含量少,直接镜检阳性率较低,早期孢子丝菌的诊断主要依赖于组织病理及真菌培养。病理组织切片特殊染色,如过碘酸雪夫染色,六胺银染色可检测到真菌孢子。组织真菌培养是检测的金标准,但耗时较长,至少需要1周时间,因此无法作为临床快速诊断的依据。随着分子生物学技术发展,核酸检测技术逐渐应用到孢子丝菌的分型和检测中,目前常用的孢子丝菌检测及分型的靶基因主要有内转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)、钙调蛋白(calmodulin,CAL)、延长因子(elongationfactors,EF)等,通过设计针对靶基因的特异性引物,扩增获得长度不同的目的片段,进一步运用琼脂糖凝胶电泳对其进行区分,从而对孢子丝菌进行种间鉴定。2015年,Rodrigues【参考文献:Rodrigues,A.M.etal.2015,9(12),e0004190.】建立了普通单重PCR检测技术可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌,是目前最灵敏和特异的致病孢子丝菌核酸检测技术。目前,临床上常用的孢子丝菌诊断方法包括直接镜检、培养、组织病理检查等。除培养外,都不能对其鉴定到种水平。由于种间形态十分相似,常需要经验丰富的真菌学专家进行鉴定,并且孢子丝菌培养耗时较长,通常需2-4周,不适用于临床早期诊断。目前常用的分子鉴定手段主要包括对目的片段扩增及测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)以及特异性引物普通PCR检测等。2015年,Rodrigues建立了普通单重PCR检测技术,可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌,是目前最灵敏和特异的致病性孢子丝菌核酸检测技术。该方法使用普通PCR技术,检测的灵敏度和特异性与荧光PCR相比相对较低,对每种致病孢子丝菌均需单独扩增,并进行凝胶电泳对扩增产物进行鉴定和检测,总检测时间至少需要三个小时以上。因此,建立更加灵敏、特异、便捷的区分不同种致病性孢子丝菌的检测技术非常必要。实时荧光定量PCR方法在目标物检测灵敏度水平具有普通单重PCR不可逾越的优势,然而针对孢子丝菌的主要致病菌球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)的三重荧光定量PCR至今未见报道。孢子丝菌不同亲缘种之间的基因序列极其相似,钙调蛋白(800bp左右)作为蛋白编码基因,相对保守,能够对不同种的孢子丝菌进行区分,公认为是鉴定孢子“条形码”。即便如此,孢子丝菌钙调蛋白序列种间之间差异仍然较小,只有个别的片段碱基序列不同。另外,荧光定量PCR对于特异性引物和探针的设计具有较高的要求和需满足的原则,其要求目标核苷酸序列长度在100-150bp左右,因此在较小的片段中很难找到即有种间差异又符合荧光PCR要求的目标序列,并且在这段长度较小的序列中,不仅要设计出适合的引物,也要设计出符合要求的特异性探针。将孢子丝菌钙调蛋白序列中具有种间差异性的目标序列输入软件中,无法找到符合荧光PCR要求特异性的引物及探针。只能根据经验,进行人工调整及较对,并通过简并碱基减少不同菌株之间的点突变对引物设计造成的影响,使用MGB探针缩短长度,提高探针的特异性。此外,多重荧光PCR体系中往往具有多对引物及多条探针,其设计要求往往比单重荧光PCR更高、更复杂。只有通过不断地调整,最终才能选择出GC含量适合,自身不会形成发夹结构,相互之间不会形成二聚体的引物及探针。因此,对于多重荧光PCR鉴定不同种的孢子丝菌来说,采用公知的引物设计软件并不能获得满足要求的引物和探针。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鉴别球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌的三重荧光定量PCR方法以及用于该方法的特异性引物和探针。为实现上述目的,专利技术人通过NCBI数据库已报道的孢子丝菌所有种属基因组进行比对,选取孢子丝菌属特异性钙调蛋白基因序列进一步进行序列分析,使用PrimerExpressVersion软件设计球形孢子丝菌(以下简称SG)、申克孢子丝菌(以下简称SS)、巴西孢子丝菌(以下简称SB)特异性扩增引物和探针,并建立一种三重荧光PCR检测体系,适用于SS,SB和SG的快速核酸检测。本专利技术首先提供了用于鉴别孢子丝菌的特异性探针组合,其具有SEQIDNO.3-5所示的序列,所述三种孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)。本专利技术提供了上述特异性探针组合在制备鉴别球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术还提供了与所述的特异性探针组合搭配使用的特异性引物对,其具有SEQIDNO.1-2所示的序列。该特异性引物对可用于鉴别上述三种孢子丝菌。进一步,本专利技术提供了上述特异性引物在制备鉴别球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术提供了一种用于鉴别孢子丝菌的荧光定量PCR特异性引物和探针组合,所述荧光定量PCR特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示;所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3-5所示,且三条探针标记的荧光基团不相同;所述孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于鉴别孢子丝菌的特异性探针组合,其含有三条特异性探针,所述特异性探针分别具有SEQ ID NO.3‑5所示的序列,所述孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrix bransiliensis)。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别孢子丝菌的特异性探针组合,其含有三条特异性探针,所述特异性探针分别具有SEQIDNO.3-5所示的序列,所述孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)。2.权利要求1所述的特异性探针组合在制备鉴别球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。3.一种与权利要求1所述的特异性探针组合搭配使用的特异性引物对,其具有SEQIDNO.1-2所示的序列。4.一种用于鉴别孢子丝菌的荧光定量PCR特异性引物和探针组合,其特征在于,所述荧光定量PCR特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示;所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3-5所示,且三条探针标记的荧光基团不相同;所述孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(Sporothrixbransiliensis)。5.权利要求4所述的荧光定量PCR特异性引物和探针组合在制备鉴别球形孢子丝菌(Sporothrixglob...

【专利技术属性】
技术研发人员:李福秋张明瑞吕莎姚春丽夏建新牟妍刘士瑞周盈
申请(专利权)人:吉林大学
类型:发明
国别省市:吉林,22

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