本发明专利技术属于环境检测领域，公开了一种Nrf2‑ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用，具体的检测方法为：先将所述环境颗粒物在生理盐水中悬浮至浓度为5～10mg/mL，再将悬浮液依次经过超声处理、涡旋处理和离心处理，收集上清液制成环境颗粒物提取液，再利用Nrf2‑AR荧光素酶报告基因检测所述环境颗粒物提取液的毒性。本发明专利技术的检测方法是基于细胞的在体方法，操作简单，结果准确，成本低且不需要非常昂贵的大型分析仪器，适合大规模的使用。
Application of Nrf2-ARE Pathway in Rapid Detection of Environmental Particulate Matter Toxicity
The invention belongs to the field of environmental detection, and discloses an application of Nrf2 ARE pathway in rapid detection of environmental particulate matter toxicity. The specific detection method is as follows: firstly, the environmental particulate matter is suspended to a concentration of 5-10 mg/mL in normal saline water, then the suspension is processed by ultrasound, eddy and centrifugation in turn, and the supernatant is collected to form an extract of Environmental Particulate matter, which is then advantageous. The toxicity of the environmental particulate matter extract was detected by Nrf2 AR luciferase reporter gene. The detection method of the present invention is cell-based in vivo method, simple operation, accurate results, low cost and does not require expensive large-scale analytical instruments, and is suitable for large-scale use.
【技术实现步骤摘要】
Nrf2-ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用
本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种Nrf2-ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用。
技术介绍
环境颗粒物(PM)，包括由燃烧产生的纳米颗粒，被人体吸入后会对人体造成有害影响。来自城市垃圾焚烧厂的飞灰介导的毒性可能是由颗粒表面的可溶性化合物如不稳定的金属离子和有机化合物作用直接生成自由基(ROS)引起的，这些成分还被认为是造成PM毒性的主要原因，焚烧产生的PM会产生大量的持久性自由基(EPFRs)，这些EPFRs已被证明可以增强由PM介导的细胞氧化应激和细胞毒性。转录因子Nrf2是调控细胞保护性转录程序、抵抗氧化应激的主要调节因子。在正常的氧化还原稳态的条件下，一种存在于细胞质中的Cullin-3E3连接酶的接头蛋白Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-likeECH-associatedprotein1,Keap1)，直接与Nrf2结合并介导蛋白质的蛋白酶体降解。在氧化应激下，亲电子或ROS修饰Keap1的半胱氨酸残基，改变Keap1-Nrf2-Cullin-3蛋白复合物，导致Nrf2易位至细胞核。在细胞核中，Nrf2与小Maf蛋白结合，激活一系列细胞保护性基因的表达。上述细胞保护性基因的协调反应通过它们启动子上的顺式作用元件调节，称为抗氧化反应元件(ARE)或亲电子反应元件。5'-TGACNNNGC-3'已被表征为ARE的核心序列。通过ARE位点，600多个细胞保护性基因已被鉴定为Nrf2的下游基因，其中包含编码II期解毒酶和抗氧化蛋白如血红素加氧酶1(hemeoxygenase1,HO-1)、NAD(P)H：醌氧化还原酶1、醛酮还原酶C1(AKR1C1)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基。尽管Nrf2在机体排毒和炎症中发挥重要作用，但最近的研究表明Nrf2有致癌作用。越来越多的证据表明，Nrf2的过度表达或过度活化可能参与肿瘤发生。Nrf2已被证明可直接参与细胞生长和存活相关基因的调控，并通过表皮生长因子受体-丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2-细胞外信号调节激酶轴部分参与细胞增殖的调节。研究表明，Nrf2-ARE通路激活是暴露于PM后机体的第一道防御反应，然而，Nrf2/ARE通路在PM毒性监测中的应用尚未知晓。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了Nrf2-ARE通路的新用途，即在检测环境颗粒物毒性中的新应用。一种Nrf2/ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用。所述环境颗粒物来源为机动车尾气排放、煤炭燃烧、生物质燃烧、道路扬尘。所述环境颗粒物的主要成分为以下几种：(1)重金属，以Zn、Pb、Ba、Cu最为丰富；(2)多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)、挥发性有机物、醌类化合物以及非金属离子。所述快速检测的方法为：将所述环境颗粒物制成环境颗粒物提取液后，再基于Nrf2/ARE通路利用荧光素酶报告基因检测所述环境颗粒物提取液的毒性，所述方法检测结果准确，操作简单，适合大规模使用。所述环境颗粒物提取液的制备方法为：将环境颗粒物在生理盐水中悬浮至浓度为5～10mg/mL，再将悬浮液依次经过超声处理、涡旋处理和离心处理，收集上清液即为环境颗粒物提取液。所述离心处理具体为：在4～8℃条件下，以10000～13000×g离心10～30min；所述超声处理具体为用超声波仪器在200V下超声处理。本专利技术利用上述特定制备方法得到的环境颗粒物提取液在形态上保留了原环境颗粒物的特征，提取液上还保留了其持续激活Nrf2-ARE通路的微量毒性成分，该微量毒性成分能导致DNA损伤突变。所述荧光素酶报告基因检测方法具体为：先培养细胞，再将细胞转染荧光素酶报告基因质粒，最后将转染后的细胞暴露于环境颗粒物提取液中24h，检测Nrf2-ARE荧光素酶报告基因的活性。上述细胞选自MCF7细胞、Hepa1细胞、HepG2细胞、HEK293细胞或Caco2细胞，优选为MCF7细胞，这是因为MCF7细胞Nrf2-ARE荧光素酶的活性本底水平低，所以当细胞暴露于环境颗粒物提取液后Nrf2-ARE荧光素酶的诱导易检测。本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术的检测方法是一基于细胞的在体方法，适用于大规模的使用，操作简单，结果准确，成本低且不需要非常昂贵的大型分析仪器。附图说明图1为飞灰颗粒提取液的透射电镜图；图2为飞灰颗粒提取液诱导的ARE-荧光素酶活性的剂量依赖性图；图3为飞灰颗粒提取液诱导由ARE驱动的基因表达的免疫印迹图；图4(A)为飞灰颗粒提取液诱导DNA链断裂图，图4(B)为tBHQ或CuCl2诱导DNA链断裂图；具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行具体描述，但本专利技术并不限于这些实施例。在以下的实施例中，超声波仪器的型号和产地为BioruptorTMUCD-200，Diagenodesa.，Liège，比利时；MCF7细胞来自美国模式培养物集存库(中国上海)；用于细胞培养的所有培养基成分均来自Invitrogen(中国上海)；PLB为被动裂解液(Passivelysisbuffer，PLB)，购自美国Promega公司(上海)；免疫印迹分析所用化合物购自于美国Sigma公司(上海)。1、方法(1)制备飞灰颗粒提取液：随机选择了来自中国四个城市的城市固体废物的工业燃烧的飞灰颗粒为样本，再将收集的样本在生理盐水中新鲜悬浮至终浓度为10mg/mL，用超声波仪器在200V下超声，再在涡旋仪上涡旋，然后在8℃条件下以13000×g离心10min，收集上清液，得到四个城市的飞灰颗粒提取液，分别命名为FA01、FA02、FA04、FA05。(2)检测飞灰颗粒提取液的毒性(2-1)荧光素酶报告基因活性检测方法为：(a)将MCF7细胞在37℃、95％空气和5％CO2条件下培养在含有10％胎牛血清和抗生素的DMEM中，每3-4天传代一次；(b)将MCF7细胞以4000个/孔的密度种96孔板，次日转染荧光素酶报告基因质粒，包括pGL3P-10xARE，其中以PGL3-Promoter做阴性对照，对每个处理组，每种质粒转染三个复孔，重复三次实验；(c)转染24h后，将每个细胞株分为两组，每组分别用DMSO、上述4种飞灰颗粒提取液和tBHQ(对照)处理24h，然后弃去培养基，每孔用200μL1×PBS洗一次，每孔用20μL1×PLB裂解细胞。然后，置于混旋仪上750rpm室温振荡20分钟，将细胞裂解液缓慢转移至96孔白板。每孔迅速加入20μL荧光素酶底物，放入GLOMAX(Promega，US)96孔板光度计中检测，计算每组的平均值。将阴性对照DMSO组的读数均设为1，处理组(tBHQ组)的读数为原始读数与DMSO组读数的比值，用外源性物质处理细胞时，培养基中不加血清。每次实验中每种处理至少三个重复。(2-2)免疫印迹分析：将上述MCF7细胞暴露于飞灰颗粒提取液FA01和FA02中24h，用AKR1C(兔多抗，1/2000稀释)(SantaCruz，US)或HO-1(兔多抗，1/2000稀释)(SantaCruz，US)特异性抗体对细胞裂解产物进行免疫印迹分析，所用二抗为过氧化物酶偶联的羊抗兔多抗(1/200本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Nrf2/ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用。
【技术特征摘要】
1.Nrf2/ARE通路在快速检测环境颗粒物毒性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的环境颗粒物的来源为机动车尾气排放、煤炭燃烧、生物质燃烧或道路扬尘。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述快速检测的方法为：将所述环境颗粒物制成环境颗粒物提取液，再基于Nrf2/ARE通路利用荧光素酶报告基因检测所述环境颗粒物提取液的毒性。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环境颗粒物提取液的制备方法为：将环境颗粒物在生理盐水中悬浮至浓度为5～10mg/mL，再将悬浮液依次经过超声处理、涡旋处理和...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐修文，王秀君，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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