一种DNase I活性比色检测法制造技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA调节MIL‑53(Fe)过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I，DNase I)活性比色检测法。本发明专利技术使用价格低廉的3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)为比色底物，基于ssDNA可有效调节MIL‑53(Fe)过氧化物酶活性的特性，利用DNase I对ssDNA的水解作用，构建了可实现裸眼观测DNase I活性的生物传感器。发展出一种具有成本低、操作简单、方便快捷等优点的比色分析法。本方法灵敏度高、稳定性好，适宜推广应用。

A Method for Detecting DNase I Activity by Colorimetry

The invention discloses a colorimetric method for detecting the activity of deoxyribonuclease I (DNase I) based on DNA regulating the activity of MIL 53 (Fe) peroxidase. The invention uses cheap 3,3', 5,5'tetramethylbenzidine (TMB) as a colorimetric substrate, and based on the characteristics of ssDNA that can effectively regulate the activity of MIL_53 (Fe) peroxidase, a biosensor capable of naked eye observation of DNase I activity is constructed by using the hydrolysis of DNase I to ssDNA. A colorimetric analysis method with the advantages of low cost, simple operation, convenience and rapidity was developed. The method has high sensitivity and good stability, and is suitable for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种DNaseI活性比色检测法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种基于DNA调节MIL-53(Fe)过氧化物酶活性的DNaseI活性比色检测法。
技术介绍
DNaseI是一种可以水解单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。它广泛分布于哺乳动物体液和组织中，尤其是垂体和胰腺。除了众所周知的胰腺消化作用外，DNaseI在DNA修复、基因重组和细胞凋亡中发挥重要作用。DNaseI的缺乏或减少可以造成人类系统性红斑狼疮、胃癌和结肠癌，而乳腺癌和糖尿病患者血清中的DNaseI活性高于正常水平。此外，DNaseI已被用作急性心肌梗塞和短暂性心肌缺血等心血管疾病的诊断标记物。因此，开发一种灵敏度高和选择性好的DNaseI活性分析方法对于生物分析、临床诊断和药物筛选至关重要。传统检测DNaseI活性方法有酶联免疫吸附测定，微芯片电泳法，电化学测定法，荧光法，比色法等等。其中，具有操作简便，性价比高，结果可肉眼观察等优点的比色法，成为DNaseI检测的主流方法。金属有机骨架(MOFs)材料是一种相对较新的多孔结晶材料，由过渡金属离子或簇与多功能有机配体相连接而成。据报道，基于铁的MOF如MIL-53，MIL-88，MIL-101等表现出过氧化物酶的催化活性，他们被成功的应用于H2O2，抗坏血酸，葡萄糖等物质的比色生物传感器的设计中。自从Mirkin和Alivisatos小组创立开创性工作以来，涉及DNA的杂交材料已被广泛报道用于各种应用，例如纳米结构的定向组装，生物传感和药物输送。受益于其高度可编程的特征，目标特异性结合或裂解，结构转换能力以及生物界面上独特的相互作用，DNA是非常出色的生物聚合物，并已广泛纳入生物纳米技术。研究发现，将核酸与MOFs通过共价键或分子间作用力相结合可以促进MOFs的额外分子识别能力和稳定性。寡核苷酸-MOFs复合物作为荧光探针来实现H5N1抗体，DNA和Hg2+的检测已有报道。Chen报道了一种核酸功能化的纳米尺寸金属有机框架(NMOFs)，用于负载刺激反应媒介(荧光探针或抗癌药物)。Ju开发出DNA功能化的铁卟啉MOFs与AuNPs和链霉亲和素(SA)作为电化学探针，实现实时Pb2+和DNA检测。然而，使用DNA来调节MIL-53(Fe)固有的过氧化物酶性质的研究仍然鲜有报道。研究报道，纳米界面上的寡核苷酸通过促进酶-底物亲和力显著增强纳米酶的固有酶活性，也有研究表明DNA的存在抑制酶活性由于物理阻碍或静电排斥。受这些报道的启发和我们持续的研究兴趣，本专利技术发现不同长度的单链DNA(ssDNA)可以有效调节MIL-53(Fe)的过氧化物酶活性，其中拥有较长碱基数的长链ssDNA拥有更强的促进作用，而碱基数偏少的短链ssDNA却无法有效影响MIL-53(Fe)的过氧化物酶活性。不同ssDNA长度提供了不同的酶-底物亲和力。基于这一特性，结合DNaseI对长链ssDNA有效水解成短链ssDNA的性质，我们开发了一种简单可靠的比色传感器来检测DNaseI的活性。据我们所知，这项研究是应用ssDNA调节MIL-53(Fe)的过氧化物酶活性测定DNaseI的一个少见的例子。其性能满足方便，快速，灵敏，特异性检测DNaseI的要求，因此在不久的将来可能有很大的潜在临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于DNA调节MIL-53(Fe)过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI，DNaseI)活性比色检测法，一种基于DNA调节MIL-53(Fe)过氧化物酶活性用于简单、廉价、有效、快速检测DNaseI活性的比色法。所述方法基于DNaseI对长链ssDNA有效水解成短链ssDNA的性质，同时利用不同长度ssDNA对MIL-53(Fe)的过氧化物模拟酶活性影响的差异，使用价格低廉并且氧化产物显蓝色的比色底物TMB，构建切实可行有效的比色检测方案。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于DNA调节MIL-53(Fe)过氧化物酶活性的DNaseI活性比色检测法，所述方法具体包括如下步骤：(1)以成本低廉的对苯二甲酸和FeCl3·6H2O作为反应原料合成金属有机骨架材料MIL-53(Fe)：首先，将0.334g的对苯二甲酸和0.545g的FeCl3·6H2O溶于10mL的DMF中，并将该混合物在室温下搅拌10分钟。将所得溶液转移到50mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，然后密封并置于150℃的烘箱中17小时。(2)待将步骤(1)中的产物冷却至室温后，通过以6000rpm离心3分钟收集黄色沉淀，并用去离子水彻底冲洗以除去多余的反应物。产物在60℃下真空干燥24小时。最后，获得黄色产物MIL-53(Fe)。(3)将步骤(2)中得到的MIL-53(Fe)配制成水溶液待用，每次使用前在震荡器上混匀。(4)将ssDNA置于1×DNaseI反应缓冲液(10mMTris-HCl，2.5mMMgCl2，0.5mMCaCl2，pH7.6)中，在95℃加热5分钟后缓慢冷却至室温。然后，向上述溶液中加入不同浓度的DNaseI并在37℃下反应2小时。(5)接下来，将步骤(3)中配制的MIL-53(Fe)加入步骤(4)的体系中。随后，加入浓度为10mM、pH4.0的NaOAc-HAc作为缓冲溶液，加入溶解于乙醇中的TMB作为反应底物，随后加入H2O2引发反应。(6)将步骤(5)的体系在40℃反应40分钟后，离心样品以从混合物中除去MIL-53(Fe)，通过检测上清液的UV-Vis吸收信号完成DNaseI活性的分析。所述步骤(1)中MOF材料MIL-53(Fe)的尺寸约为1-3μm。所述步骤(4)中加入的ssDNA浓度为200nM。所述步骤(5)中加入的MIL-53(Fe)终浓度为5μgmL-1。所述步骤(5)中的NaOAc-HAc溶液的制备方法是：将NaOAc与HAc混合配制成pH值为4-9的NaOAc-HAc溶液，所述pH优选为4.0。所述步骤(5)中加入的溶于乙醇的TMB浓度为0.2mM。所述步骤(5)中加入的H2O2浓度为2.5mM。所述步骤(6)中待测DNaseI的检测浓度范围为0.2～7UmL-1(R2＝0.997)，检出限为0.09UmL-1。更具体地，本专利技术所述的一种基于DNA调节MIL-53(Fe)过氧化物酶活性的DNaseI活性比色检测法，包括如下步骤：(1)以0.334g的对苯二甲酸和0.545g的FeCl3·6H2O作为反应原料溶于10mL的DMF中，并将该混合物在室温下搅拌10分钟。将所得溶液转移到50mL聚四氟乙烯里的不锈钢高压釜中，然后密封并置于150℃的烘箱中17小时。(2)待将步骤(1)中的产物冷却至室温后，通过以6000rpm离心3分钟收集黄色沉淀，并用去离子水彻底冲洗以除去多余的反应物。产物在60℃下真空干燥24小时。最后，获得黄色产物MIL-53(Fe)。(3)将步骤(2)中得到的MIL-53(Fe)配制成水溶液待用，每次使用前在震荡器上混匀。(4)将200nM的ssDNA加入200μL的PCR管在LifeECOPCR仪器(BIOER，Hangzhou)中95℃加热5分钟并缓慢冷却至室温。然后，在1×D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNaseI活性比色检测法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以对苯二甲酸和FeCl3·6H2O作为反应原料合成金属有机骨架材料MIL‑53(Fe)：首先，将0.334g的对苯二甲酸和0.545g的FeCl3·6H2O溶于10mL的DMF中，并将该混合物在室温下搅拌10分钟，将所得溶液转移到50mL聚四氟乙烯衬z里的不锈钢高压釜中，然后密封并置于150℃的烘箱中17小时；(2)待将步骤(1)中的产物冷却至室温后，通过以6000rpm离心3分钟收集黄色沉淀，并用去离子水彻底冲洗以除去多余的反应物；产物在60℃下真空干燥24小时，最后，获得黄色产物MIL‑53(Fe)；(3)将步骤(2)中得到的MIL‑53(Fe)配制成浓度为0.1mg/mL的水溶液待用，每次使用前在震荡器上混匀；(4)将ssDNA置于1×DNaseI反应缓冲液(10mMTris‑HCl，2.5mMMgCl2，0.5mMCaCl2，pH7.6)中，在95℃加热5分钟后缓慢冷却至室温，然后，向上述溶液中加入不同浓度的DNaseI并在37℃下反应2小时；(5)接下来，将步骤(3)中配制的MIL‑53(Fe)加入步骤(4)的体系中，随后，加入浓度为10mM、pH＝4.0的NaOAc‑HAc作为缓冲溶液，加入溶解于乙醇中的TMB作为反应底物，随后加入H2O2引发反应；(6)将步骤(5)的体系在40℃反应40分钟后，离心样品以从混合物中除去MIL‑53(Fe)，通过检测上清液的UV‑Vis吸收信号完成DNaseI活性的分析。...

【技术特征摘要】
1.一种DNaseI活性比色检测法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以对苯二甲酸和FeCl3·6H2O作为反应原料合成金属有机骨架材料MIL-53(Fe)：首先，将0.334g的对苯二甲酸和0.545g的FeCl3·6H2O溶于10mL的DMF中，并将该混合物在室温下搅拌10分钟，将所得溶液转移到50mL聚四氟乙烯衬z里的不锈钢高压釜中，然后密封并置于150℃的烘箱中17小时；(2)待将步骤(1)中的产物冷却至室温后，通过以6000rpm离心3分钟收集黄色沉淀，并用去离子水彻底冲洗以除去多余的反应物；产物在60℃下真空干燥24小时，最后，获得黄色产物MIL-53(Fe)；(3)将步骤(2)中得到的MIL-53(Fe)配制成浓度为0.1mg/mL的水溶液待用，每次使用前在震荡器上混匀；(4)将ssDNA置于1×DNaseI反应缓冲液(10mMTris-HCl，2.5mMMgCl2，0.5mMCaCl2，pH7.6)中，在95℃加热5分钟后缓慢冷却至室温，然后，向上述溶液中加入不同浓度的DNaseI并在37℃下反应2小时；(5)接下来，将步骤(3)中配制的MIL-53(Fe)加入步骤(4)的体系中，随后，加入浓度为10mM、pH＝4.0的NaOAc-HAc作为缓冲溶液，加入溶解于乙醇中的TMB作为反应底物，随后加入H2O2引发反应；(6)将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋婵，丁炜，姚玥玮，姚成，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32