一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括：斜面菌种培养，液体种子培养，液体发酵培养等步骤，发酵培养过程中向发酵液中流加补料蔗糖溶液，尤其发酵到48h后，通过向发酵液中每天间歇或连续补入特异性的前体0.05％的乙酸钠溶液，显著提高了发酵产物中A3的含量，同时也提高了米尔贝霉素的发酵产量。

A Method for Increasing the Content of Milbemycin A3 in Milbemycin Fermentation Products

The invention discloses a method for increasing the content of milbemycin A3 in milbemycin fermentation products, which comprises the following steps: slant bacterial culture, liquid seed culture, liquid fermentation culture and so on, feeding sucrose solution into fermentation broth during fermentation culture, especially after fermentation for 48 hours, adding 0.05% sodium acetate as a specific precursor to fermentation broth intermittently or continuously every day. Solution significantly increased the content of A3 in fermentation products, and also increased the fermentation yield of milbemycin.

【技术实现步骤摘要】
一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法
本专利技术涉及一种米尔贝霉素的发酵工艺，属于生物制药
，特别涉及到用微生物液体深层发酵技术生产米尔贝霉素的方法。
技术介绍
米尔贝霉素(Milbemycin)是一系列十六元大环内酯类抗生素的混合物，由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)经发酵产生。米尔贝霉素的20多种组分中大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫，尤其对各种螨类都有较高的防治效果。米尔贝霉素具有对害虫作用强烈，用药量少，对人畜安全，不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，也不易产生抗药性的特点，是一种非常有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。在米尔贝霉素系列药物中，由于米尔贝霉素A3、A4的生物活性较强，产量较高，所以米尔贝霉素产品的商业化都围绕着米尔贝霉素A3、A4来进行。除了米尔贝霉素A3、A4的混合物广泛被用作杀螨剂以外，米尔贝霉素A3、A4的半合成肟化产物，米尔贝肟(Milbemycinoxime，米尔贝肟，CAS号:129496-10-2)，是一种新型的大环内脂类驱虫药，对体内体外寄生虫均有良好的驱杀作用，对控制和预防大部分常见的宠物寄生虫病都有很好的效果。米尔贝肟尤其是以其低毒高效的特点被公认为是一种广谱、高效、安全的驱虫药，特别是对一些对伊维菌素敏感的犬只更为安全。米尔贝肟由米尔贝肟A3和米尔贝肟A4以一定比例混合组成，要求米尔贝肟A3+A4的含量不应小于95％，其中A3和A4的比例为(20±5)：(80±5)。米尔贝肟A3、A4的结构式如下式所示：米尔贝肟A3(MilbemycinOximeA3)：R＝CH3米尔贝肟A4(MilbemycinOximeA4)：R＝CH2CH3工业上主要用吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)发酵生产米尔贝霉素，在发酵过程中，米尔贝霉素A3、A4是被菌体同时产生的，以混合物的形式存在于发酵液中。由于A3、A4的结构和性质都非常相似，仅仅在C-25上的取代基不同，分别是甲基和乙基，从发酵液中分离出A3、A4单一组分非常困难，所以目前工业上一般都把A3、A4视为同一组分，一起从发酵液中提取分离出来，再经过氧化、肟化等一系列的半合成步骤后，最后经过分离纯化得到米尔贝肟成品。这就要求从一开始，发酵液中的米尔贝霉素A3与A4的比例就必须恰好是在(20±5)：(80±5)范围内，这样最后得到的米尔贝肟A3与A4的比例才能够符合要求。目前国内米尔贝肟的发酵生产中遇到一个难题，每批发酵随着发酵进程的持续，米尔贝霉素总体发酵单位持续增长，但发酵中后期A3的发酵单位增长相对较慢，导致A3/A4的比例也在不断的下降，从发酵中期的1:3左右，到放罐前下降到1:7左右，而最终产品的要求是1:4左右，所以经常不得不在发酵单位还较低的时候就提前放罐。生产中遇到的这个难题就急需要找到一种方法，能够特异性的提高A3的产量，而不影响A4的产量，这样不仅能从整体上提高了米尔贝霉素的产量，而且还能够大大降低后续半合成生产米尔贝肟的难度，大幅度降低生产成本。根据对米尔贝霉素α2、α4和D组分的400MHz13C核磁共振谱的解析，其配糖体骨架上的碳是从7个乙酸根和5个丙酸根衍生而来，与阿维菌素配糖体骨架的构成完全相同。所以根据阿维菌素合成途径(HIkeda,SOmura.ControlofavermectinbiosynthesisinStreptomycesavermitilisfortheselectiveproductionofausefulcomponent.《Cheminform》,1996,27(1):549-62)来推断，米尔贝霉素A3组分的C-25位上的甲基取代基是由乙酸盐代谢衍生得到，A4组分的C-25位上的乙基取代基是由丙酸盐代谢衍生得到。
技术实现思路
本专利技术在现有的发酵生产米尔贝霉素技术的基础上，通过在发酵过程中适量补加特定的前体物质乙酸钠，解决了发酵中后期米尔贝霉素A3产量增长缓慢的技术问题，提供了一种可以特异性增加米尔贝霉素A3发酵产量的工艺方法，从而提高了米尔贝霉素发酵产物中A3的比例。本专利技术人通过研究发现，米尔贝霉素是吸水链霉菌的次级代谢产物，米尔贝霉素A3结构中的特异配基是来自于乙酸根的，而相对的，米尔贝霉素A4结构中的特异配基是来自于丙酸根，说明乙酸根有可能是米尔贝霉素A3生物合成的特异性前体物质，在发酵液中额外补加乙酸盐有可能增加米尔贝A3的合成，而不影响A4的合成，这样就可以通过在发酵液中适量添加乙酸钠的方法，增加A3的产量，而不增加A4产量，从而达到改善A3/A4比例的目的。本专利技术人通过实验证实，在发酵配方中适量添加乙酸钠能够小幅度提高米尔贝霉素A3的产量，同时对米尔贝霉素A4的产量基本没有影响。在以上研究基础上，推测在米尔贝霉素的发酵培养基中适量添加乙酸根可以节省菌体自身合成乙酸根所需的时间和营养，从而提高A3的产量，但是通过实验发现，采用在发酵基础培养基中添加乙酸根的措施，提高A3产量的效果并不明显，而在发酵周期48h后，初级代谢基本完成，次级代谢占据主要地位的时候补加乙酸根则有较好的效果，尤其是分次每天补加或连续流加的效果更优。在以上研究的基础上，通过以下技术手段实现米尔贝霉素A3发酵产量和比例的显著提高：(1)斜面菌种培养：将吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)菌种接种于斜面培养基，在温度27-29℃，湿度20-60％条件下培养10-12天，得到成熟的斜面菌种。斜面培养基配方为蔗糖0.4％，脱脂奶粉0.1％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.1％，琼脂2.0％。(2)液体种子培养：从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-500rpm条件下培养40-48小时，得到成熟的种子液。液体种子培养基配方为蔗糖2％，脱脂奶粉0.1％，黄豆饼粉0.5％，蛋白胨0.5％，碳酸钙0.1％。(3)液体发酵培养：将成熟的种子液按照4-12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度27-29℃，搅拌转速100-600rpm的条件下发酵培养，发酵到120h后，取样测定罐上发酵液中蔗糖浓度，当蔗糖浓度降低到2.0％以下时，开始补蔗糖溶液，维持罐上发酵液中蔗糖的浓度在1.5-2.5％之间，放罐前12h停止补糖。发酵240-288h后结束发酵，得到含有米尔贝霉素的发酵液。液体发酵培养基配方为：蔗糖8％，脱脂奶粉1.0％，黄豆饼粉1.0％，蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸亚铁0.1％，硫酸锌0.01％，硫酸铜0.05％，钼酸钠0.05％，碳酸钙0.5％。(4)发酵补前体：发酵到48h后，每天在发酵液中补入0.05％的乙酸钠，将乙酸钠配成5％浓度的溶液，灭菌后，每天按照发酵液体积的1％将乙酸钠溶液补入发酵罐中。本专利技术技术方案如下：一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括发酵过程中，向发酵液中补入一定量的乙酸盐。进一步地，所述乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌等中的一种或几种，优选为乙酸钠。进一步地，所述乙酸盐以溶液的形式添加；所用乙酸盐溶液的浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括发酵过程中，向发酵液中补入一定量的乙酸盐。

【技术特征摘要】
1.一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括发酵过程中，向发酵液中补入一定量的乙酸盐。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、乙酸锌中的一种或几种；优选地，所述乙酸盐以溶液的形式添加；优选所用乙酸盐溶液的浓度为0.5％-20％，更优选为浓度5％的乙酸钠溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵到48h时，每天在发酵液中补入一定量的乙酸盐，直至发酵结束；和/或，每天向发酵液中补入的乙酸盐的量为0.01-0.1％，优选为0.05％。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，向发酵液中补入乙酸盐的方式为每天一次间歇补入或用连续流加的方式补入。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，当发酵液中总糖浓度降低到2.0％以下时，开始补加蔗糖溶液，维持发酵液中总糖的浓度在1.5-2.5％之间；优选地，当发酵到120-150h后，当发酵到120-150h后，检测发酵液中总糖浓度，当发酵液中总糖浓度降低到2.0％以下时，开始补加蔗糖溶液，维持发酵液中总糖的浓度在1.5-2.5％之间；更优选地，结束发酵前12h停止补加蔗糖。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，发酵条件包括：温度27-29℃，搅拌转速100-600rpm，通气量0.4-1.2vvm，控制发酵罐上溶氧值(DO)≥30％；和/或，发酵240-288h后结束发酵。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所用发酵菌种为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)。8.根据权利要求1-7任一项所述方法，其特征在于，包括如下步骤：1)斜面菌种...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵子刚，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11