一种提高L-蛋氨酸产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种所述方法将重组大肠杆菌W3110接种至含Ca

A Method for Increasing L-Methionine Production

The invention discloses a method for inoculating recombinant Escherichia coli W3110 into Ca-containing bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种提高L-蛋氨酸产量的方法
本专利技术涉及一种利用重组大肠杆菌发酵提高蛋氨酸产量的方法。
技术介绍
L-蛋氨酸(L-Methionine)是八种必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，又名甲硫氨酸。分子式为C5H11NO2S，相对分子质量为149.21，性状为白色薄片状结晶或结晶型粉末，有特殊气味，味微甜，溶于水(3.3g/100mL，25℃)、稀酸或稀碱。蛋氨酸参与动物体内甲基的转移及磷的代谢，降解可生成肌酸，而肌酸和磷酸肌酸在能量储存及利用中起重要作用。同时，还参与动物机体肾上腺素、胆碱的合成，许多试验表明蛋氨酸可增加禽类的日增重，缩短育肥周期，降低养殖成本。因此蛋氨酸为家禽饲料里必不可少的添加剂。除此之外。L-蛋氨酸还广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。目前国内外市场上的蛋氨酸以化学法合成为主，化学法有丙烯醛法(海因法)、氨基内酯法、丙二酸酯法、固液相转移催化等方法。其中以甲硫醇、丙烯醛为原料的海因法是各大厂家的主要生产方式，化学法生产蛋氨酸具有工艺简单、收率高等优势，但其在生产过程中能耗高、生产安全要求高，光学纯度低，并且产生大量含氮、含硫有机物废水(如剧毒的氰化物原料、中间体和废物)，如果工艺流程不合理，对废水、废气的处理不当，将对周边环境造成严重污染。因此，相对而言，生物法合成蛋氨酸具有很大的市场潜力与良好的应用前景。目前除L-蛋氨酸外其它天冬氨酸家族氨基酸均己实现微生物发酵法生产，因此如何实现L-蛋氨酸的发酵法生产成为研究热点。从上世纪70年代开始就有学者对蛋氨酸的微生物发酵合成方法进行探索，虽然目前已有一些关于微生物生产L-蛋氨酸的文献和专利报道，但由于微生物发酵合成蛋氨酸代谢调控体系复杂，菌种产量低等问题，导致生物法合成L-蛋氨酸难以实现工业化生产。目前，研究使用的L-蛋氨酸生产菌株主要是传统诱变菌株和基因工程改造菌株。印度学者Chattopadhyay等首先筛选到一株E.coliK12抗5BU的突变菌，该菌能以葡萄糖为底物，合成1g/L的L-蛋氨酸。随后他们又通过对该菌株进行NTG连续诱变，得到一株能抗苏氨酸结构类似物和L-蛋氨酸结构类似物突变菌，该菌能以葡萄糖为底物，过量合成L-蛋氨酸和苏氨酸(均为2g/L)。日本学者Nakamori等用NTG处理E.coliJM109，得到数株能够抗乙硫氨酸的突变株，其中E.coliJM109-TNI在添加1％酵母粉的培养基上，以葡萄糖为底物合成0.91g/L的L-蛋氨酸。马燕等考察了培养基中不同碳源和氮源对菌体生长及蛋氨酸产量的影响，表明甘油和葡萄糖有利于芽孢杆菌属菌株MV0073产蛋氨酸，有机氮有利于菌体生长，但不利于L-蛋氨酸的积累。闵伟红等重点考察了发酵过程中的碳源种类及浓度、pH及发酵时间等因素对北京棒杆菌AS1.299的影响，表明以葡萄糖浓度为10％作为碳源进行发酵产L-蛋氨酸量为最高，菌体浓度为最大，pH6.5有利于菌体生长和L-蛋氨酸生成。目前主要问题是国内蛋氨酸的发酵制备水平仍然较低，因此利用发酵代谢调控手段对发酵过程进行优化，提高蛋氨酸产量，对于蛋氨酸的工业化生产来说具有极其重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术目的在于通过碳源、氮源及硫源的筛选，并添加Ca2+、赖氨酸和辅因子VB12，基因改造，提供一种提高L-蛋氨酸发酵水平的方法，同时，在实验过程中发现了Ca2+离子的重要作用，它对L-蛋氨酸发酵产量的提高具有显著影响。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种提高L-蛋氨酸产量的方法，所述方法为：将重组大肠杆菌W3110接种至含Ca2+和50mg/LAmp(氨苄西林)的发酵培养基，在28℃、200r/min下培养发酵到OD600＝0.6～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h后发酵结束，获得含L-蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离提取，获得L-蛋氨酸；所述发酵培养基的终浓度组成：甘油20-50g/L(优选40g/L)，(NH4)2SO416g/L，KH2PO42g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O31-11g/L(优选7g/L)，金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH自然(优选5～7)；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O500g/L，MnSO4·8H2O5g/L，FeSO4·7H2O5g/L，ZnSO45g/L，溶剂为蒸馏水；所述重组大肠杆菌W3110是将丝氨酸到半胱氨酸途径中编码丝氨酸乙酰转移酶的基因cysE(GeneID:948126)、编码高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶基因metH(GeneID:948522)、编码5-亚甲基叶酸还原酶基因metF(GeneID:948432)、编码高胱氨酸合成基因metBL(GeneID:948433,948434)启动子均替换为trc启动子(SEQIDNO.1所示)后，导入宿主菌构建而成；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coliW3110中metJ、metI和lysA基因敲除(即赖氨酸合成支路、蛋氨酸摄取系统和合成蛋氨酸的全局阻遏蛋白)后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH，其中pTrc99A/metA*/yjeH质粒添加了蛋氨酸外分泌蛋白yieH，过表达了编码催化高丝氨酸和琥珀酰-CoA合成琥珀酰高丝氨酸的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶metA*构建获得的；本专利技术重组大肠杆菌W3110基因型为E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysATrc-metHTrc-metFTrc-cysETrc-metBL/pTrc99A/metA*/yjeH。进一步，所述Ca2+在发酵培养基中的终浓度为0.01-1mol/L，优选0.1mol/L，更优选添加10g/LCaCO3，不仅能够维持发酵过程pH为5.5-7.0，而且还能提高L-蛋氨酸产量。进一步，所述发酵培养基中还添加有赖氨酸和辅因子，所述辅因子为VB1、VB6、VB7、VB12、天冬氨酸(Asp)或柠檬酸钠(Cit-Na)中的一种，优选VB12；所述赖氨酸添加终浓度为30-160mg/L，更优选150mg/L，辅因子添加终浓度0.1-2mg/L，更优选辅因子为终浓度1.5mg/LVB12。本专利技术最优选所述发酵培养基终浓度组成为：甘油40g/L，(NH4)2SO416g/L，KH2PO41g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O37g/L、VB121.5mg/L，赖氨酸150mg/L，金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O500g/L，MnSO4·8H2O5g/L，FeSO4·7H2O5g/L，ZnSO45g/L，溶剂为蒸馏水。进一步，所述重组大肠杆菌W3110发酵前先进行种子扩大培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子扩大培养为：将重组大肠杆菌W3110接种至含50mg/LAmp种子培养基，在37℃、200r/min培养12h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。本专利技术的有益效果主要体现在：利用本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高L‑蛋氨酸产量的方法，其特征在于所述方法为：将重组大肠杆菌W3110接种至含Ca2+和50mg/L Amp发酵培养基，在28℃、200r/min下培养至OD600＝0.6～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h后发酵结束，获得含L‑蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离提取，获得L‑蛋氨酸；所述发酵培养基的终浓度组成：甘油20‑50g/L，(NH4)2SO4 16g/L，KH2PO4 2g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O3 1‑11g/L，金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O 500g/L，MnSO4·8H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4 5g/L，溶剂为蒸馏水；所述重组大肠杆菌W3110是将编码丝氨酸乙酰转移酶的基因cysE、编码高半胱氨酸‑N5‑甲基四氢叶酸转甲基酶基因metH、编码5‑亚甲基叶酸还原酶基因metF、编码胱硫醚合成酶的基因metB、编码天冬氨酸激酶II基因metL启动子均替换为trc启动子后，导入宿主菌构建而成，所述trc启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coli W3110中metJ、metI和lysA基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coli W3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH。...

【技术特征摘要】
1.一种提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于所述方法为：将重组大肠杆菌W3110接种至含Ca2+和50mg/LAmp发酵培养基，在28℃、200r/min下培养至OD600＝0.6～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h后发酵结束，获得含L-蛋氨酸的发酵液，将发酵液分离提取，获得L-蛋氨酸；所述发酵培养基的终浓度组成：甘油20-50g/L，(NH4)2SO416g/L，KH2PO42g/L，酵母提取物2g/L，Na2S2O31-11g/L，金属离子混合溶液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；所述金属离子混合溶液组成为：MgSO4·7H2O500g/L，MnSO4·8H2O5g/L，FeSO4·7H2O5g/L，ZnSO45g/L，溶剂为蒸馏水；所述重组大肠杆菌W3110是将编码丝氨酸乙酰转移酶的基因cysE、编码高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶基因metH、编码5-亚甲基叶酸还原酶基因metF、编码胱硫醚合成酶的基因metB、编码天冬氨酸激酶II基因metL启动子均替换为trc启动子后，导入宿主菌构建而成，所述trc启动子核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；所述宿主菌是将大肠杆菌E.coliW3110中metJ、metI和lysA基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建而成的E.coliW3110ΔmetJΔmetIΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH。2.如权利要求1所述提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于所述Ca2+在发酵培养基中的终浓度为0.01-1mol/L。3.如权利要求1所述提高L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛坤，许月英，柳志强，郑裕国，周海岩，吴王杰，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33