表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物技术

本发明专利技术属于疫苗制造技术领域。本发明专利技术公开了一种表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap，保藏号为CGMCC No.15691。本发明专利技术还公开了一种用于构建表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap的引物。本发明专利技术又公开了表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap的构建方法，包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK‑sPCV3；2、转移载体的构建；3、穿梭质粒的构建；4、重组杆状病毒的获得：将阳性穿梭质粒Bacmid‑ΔCap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap。本发明专利技术可以方便快捷的构建出表达PCV3截短Cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的截短Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

Recombinant baculovirus expressing truncated Cap protein of porcine circovirus type 3 and construction method and primer thereof

The invention belongs to the technical field of vaccine manufacturing. The invention discloses a recombinant baculovirus Cap rBac Cap expressing the truncated gene of porcine circovirus type 3, and its storage number is CGMCC No.15691. The invention also discloses a primer for constructing a recombinant baculovirus rBac (Cap) expressing truncated Cap gene of porcine circovirus type 3. The invention also discloses a method for constructing a recombinant baculovirus type rBac Cap, which expresses truncated Cap gene of porcine circovirus type 3, including the following steps: 1, construction of PCV3 containing whole genome pSK sPCV3; 2, construction of transfer vector; 3, construction of shuttle plasmid; 4. Obtaining of recombinant baculovirus: transfection of positive shuttle plasmid Bacmid Cap to Sf9 cells, and expression of porcine circovirus. Recombinant baculovirus rBac_Cap with truncated Cap gene of virus type 3. The recombinant baculovirus expressing PCV3 truncated CAP protein can be constructed conveniently and quickly, and it can be determined that the expressed truncated CAP protein has good biological activity and good immunogenicity is found in immunized mice.

【技术实现步骤摘要】
表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白重组杆状病毒及其构建方法与引物
本专利技术涉及表达猪圆环病毒3型(PCV3)截短Cap基因的重组杆状病毒的构建方法，用于制造疫苗。
技术介绍
猪圆环病毒病(PCVD)是当前危害养猪业的重要疾病之一，其中PCV2是导致该类疾病的主要致病因子。2016年，Phan等学者又报道了新型猪圆环病毒PCV3，该病毒可造成猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪繁殖障碍呼吸系统疾病及消化系统炎症等疾病[PhanTG,GiannittiF,RossowS,etal.DetectionofanovelcircovirusPCV3inpigswithcardiacandmulti-systemicinflammation[J].VirologyJournal,2016,13(1):184.]。通过PCV3全基因组遗传进化分析发现，PCV3与另外PCV1和PCV2两个基因型的病毒处于不同的进化分支，且PCV3各分离株之间也存在进化差异，是新型猪圆环病毒。自PCV3被报道以来，国内外多个地区均检测出该病毒，其危害正逐步受到重视。2017年初，何启盖等在我国首次检出PCV3。目前国内的PCV3毒株主要分为3a、3b和3c三种基因型，其中3a和美国PCV3参考毒株处于相同的进化分支[FuX,FangB,MaJ,etal.Insightsintotheepidemiccharacteristicsandevolutionaryhistoryofthenovelporcinecircovirustype3insouthernChina[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2018,65(2):e296-e303.]。Stadejek等对波兰境内14个商品化猪场母猪、仔猪和育成猪的血清进行PCV3检测，首次证实PCV3感染在欧洲地区同样存在[StadejekT,niakA,ekD,etal.Firstdetectionofporcinecircovirustype3oncommercialpigfarmsinPoland[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2017,64(5):1350-1353.]。为控制PCV3的进一步流行，亟需研究开发针对该病毒的商品化疫苗。PCV3与PCV1、PCV2一样为无囊膜病毒，病毒粒子也呈二十面体结构，具有2kb的单链闭合环状负链DNA基因组，包含三个最主要的开放阅读框。ORF1编码参与病毒基因组复制的相关蛋白，而ORF2编码主导免疫原性的Cap核衣壳结构蛋白，是研制PCV3亚单位基因工程疫苗的理想靶基因[NawagitgulP,MorozovI,BolinSR,etal.Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[J].JournalofGeneralVirology,2000,81(Pt9):2281-2287.]。PCV3ORF3编码由231个氨基酸组成的功能未知蛋白质。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性较低，仅为30％，此外，二者Cap蛋白的抗原表位也无任何相似性，暗示PCV3和PCV2毒株间的抗原交叉保护性可能很低，现有的PCV2疫苗已无法有效预防PCV3感染[湛洋,王东亮,王乃东,等.猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(6):1076-1084.]。研究发现，Cap蛋白N端富含精氨酸组成的核定位信号(NLS)，不含主要的抗原位点，容易使得表达的蛋白向细胞核转移，难以获得大量具有活性的Cap蛋白[LouGG,LiXR,LiZY,etal.Expressionandantigenicitycharacterizationfortruncatedcapsidproteinofporcinecircovirustype2[J].TheCanadianJournalofVeterinaryResearch,2011,75(1):61-64.]。然而全部缺失NLS则可能会影响外源蛋白的免疫原性，但缺失N端的NLS并不影响Cap在体外包装成病毒样颗粒[ZhangH,QianP,LiuL,etal.Virus-likeparticlesofchimericrecombinantPorcinecircovirustype2asantigenvehiclecarryingforeignepitopes[J].Viruses,2014,6(12):4839-4855.]。考虑到以上几点，在不影响其免疫原性基础上，为提高活性蛋白表达量，本研究通过设计一对引物用来扩增缺失NLS中34个氨基酸的截短Cap(ΔCap)，并引入Kozak序列，以期望进一步提高蛋白表达。疫苗仍是目前防控PCVD的主要手段，因此，针对新型PCV3感染的疫苗自然会成为全世界研究的热点。不同于原核表达系统、酵母及哺乳动物细胞真核表达系统，杆状病毒表达系统作为真核表达系统之一拥有外源插入基因容量大、蛋白表达水平高、操作简便及翻译后加工修饰等诸多优点而广泛使用[LinSY,ChenGY,HuYC.Recentpatentsonthebaculovirussystems[J].RecentPatentsonBiotechnology,2011,5(1):1-11.]。目前，关于PCV2亚单位疫苗的生产主要基于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，如英特威公司研制的Circumvent亚单位疫苗[BaechNM,MengXJ.Efficacyandfutureprospectsofcommerciallyavailableandexperimentalvaccinesagainstporcinecircovirustype2(PCV2).VirusRes,2012(164):33-42.]。目前关于PCV3疫苗的报道较少，通过构建重组杆状病毒进行PCV3Cap蛋白的表达，可为开发PCV3亚单位疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白及其构建方法与引物，本研究通过筛选PCV3毒株，设计了扩增PCV3全长的引物；针对PCV3截短Cap基因设计特异引物，基于Bac-to-Bac系统，获得了表达猪圆环病毒3型截短Cap蛋白的重组杆状病毒。该方法可以方便快捷的构建出表达PCV3截短Cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的截短Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。本专利技术的第一个目的是提供表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，该重组杆状病毒rBac-ΔCap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，保藏号为CGMCCNo.15691。本专利技术的第二个目的是通过以下技术方案实现的，参照GenBank上公布的PCV3序列与Cap基因全长序列独立自主设计，用于构建表达猪圆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac‑ΔCap，保藏号为CGMCC No.15691。

【技术特征摘要】
1.表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap，保藏号为CGMCCNo.15691。2.用于构建表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的引物，见表1；表1引物及酶切位点引物XhoI-3F的酶切位点为CTCGAG；引物EcoRI-3R的酶切位点为GAATTC引物ΔCap-F的酶切位点为GGATCC引物ΔCap-R的酶切位点为AAGCTT。3.表达猪圆环病毒3型截短Cap基因的重组杆状病毒rBac-ΔCap的构建方法，其特征是，所述构建方法包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：以提取的PCV3DNA为模板，用引物XhoI-3F和引物EcoRI-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与pBluescriptSK+载体同时用XhoI和EcoRI双酶切，将两种酶切产物纯化回收后进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；2、转移载体的构建：以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物ΔCap-F和引物ΔCap-R扩增PCV3Cap缺失NLS的截短Cap，即ΔCap，将PCR产物纯化后与转移载体pFastBacTMHTA共同进行BamHI和HindIII的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应，获得重组质粒pFastBacTMHTA-Cap；提取重组质粒pFastBacTMHTA-ΔCap，分别利用限制性内切酶BamHI和HindⅢ单酶切鉴定，以及BamHI-HindⅢ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，BamHI和HindⅢ分别单酶切pFastBacTMHTA-ΔCap质粒，得到5399bp单一条带；BamHI-HindⅢ双酶切重组质粒pFastBacTMHTA-ΔCap，得到4856bp和543bp两个条带；3、穿梭质粒的构建：将BamHI-HindⅢ双酶切得到4856bp和543bp两个条带的正确重组载体pFastBacTMHTA-ΔCap转化进入DH10αBac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，PCR鉴定正确后抽提重组穿梭质粒Bacmid-ΔCap；用引物pUC/M13扩增出2430bp加上插入目的片段大小的条带，即2973bp条带；根据PCR鉴定重组BacmidDNA模式图，推测计...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，程清如，高清清，王小波，郇长超，刘秀梵，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32