一种定向、高效培育耐盐水稻品种的育种方法技术

本发明专利技术涉及定向、高效培育强耐盐、强优势水稻品种的育种方法，具体公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，尤其是与杂种优势利用技术相结合定向、高效培育强耐盐、强优势水稻品种的育种方法，具体是根据水稻OsRR22外显子序列选择特异性靶位点序列，对杂交稻亲本同时进行编辑，创制耐盐性显著提高的突变系为优异耐盐亲本再进行杂交配组试验，最终选育强耐盐、强优势的杂交稻新品种。因而克服了常规耐盐水稻品种耐盐度低、优势不明显的不足，提供了一种全新的更高效的培育强耐盐、强优势杂交稻新品种的方法。

A Breeding Method for Oriented and Efficient Cultivation of Salt-tolerant Rice Varieties

The present invention relates to a breeding method for directional and efficient cultivation of rice varieties with strong salt tolerance and strong dominance. Specifically, it discloses a gene editing technique based on CRISP R/Cas9, especially a breeding method for directional and efficient cultivation of rice varieties with strong salt tolerance and strong dominance by combining with heterosis utilization technology. Specific target site sequence is selected according to rice OsRR22 exon sequence and hybridization is carried out. The parents of rice were edited at the same time, and the mutant lines with significantly improved salt tolerance were created as excellent salt tolerant parents, and then the hybrid matching experiment was carried out. Finally, the new hybrid rice varieties with strong salt tolerance and strong heterosis were bred. Therefore, it overcomes the shortcomings of conventional salt-tolerant rice varieties, such as low salinity tolerance and inconspicuous advantages, and provides a new and more efficient method to cultivate new hybrid rice varieties with strong Salt-tolerance and strong heterosis.

【技术实现步骤摘要】
一种定向、高效培育耐盐水稻品种的育种方法
本专利技术属于水稻生物技术育种领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术和杂种优势利用技术相结合定向、高效培育强耐盐、强优势水稻新品种的育种方法。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是世界上重要的粮食作物，世界上超过一半的人口以稻米为主要粮食。在我国，水稻作为第一大口粮作物，约65％的人口以稻米为主食。但当前，人口迅速膨胀、耕地面积逐年减少、粮食增长日趋缓慢等问题已逐渐危机我国的粮食安全。而另一方面，我国盐碱地总面积近15亿亩，覆盖了全国17个省份，且耕地盐碱化问题日益严重，盐碱地80％处于荒芜状态，其中雨水资源较丰富、近期可用于水稻种植的盐碱地面积达2亿亩，综合利用潜力巨大。因此，培育耐盐水稻新品种对扩大水稻种植面积和提高稻谷产量、保障我国粮食安全显得尤为重要。目前，耐盐水稻新品种培育以利用传统育种方法选育耐盐碱常规稻品种为主；需要经过多次杂交并通过系统选育才能改良受体材料的耐盐性，且存在周期长、效率低、连锁累赘、耐盐性差和产量低等不足。要突破传统耐盐育种“品种少、产量低”的局限，就必须开发一种培育耐盐水稻的新思路。CRISPR/Cas9技术作为最新一代基因编辑技术具有简单、高效、分离后代可剔除转基因成分等优势。在水稻遗传改良育种中，该技术已成功实现了对抗性、品质和育性等相关功能基因的定点编辑，如Xu等(Rice,7(1)，2014)利用CRISPR/Cas9技术对抗除草剂基因BEL为靶点进行定点突变，成功获得对除草剂-苯达松敏感的突变体水稻材料；Wang等(PlosOne，11(4)，2016)对OsERF922进行定向编辑，提高了受体水稻材料对稻瘟病的抗性；Zhou等(SciRep，6，,2016)以水稻温敏不育基因TMS5为靶点，成功培育了水稻工程温敏不育系。同时，目前在已克隆的水稻耐盐基因中，OsRR22是水稻耐盐性最重要的负调控基因之一；该基因位于水稻第1号染色体，编码一个含696个氨基酸的B型相应调节蛋白，参与细胞分裂素信号转导和代谢；而该基因的功能缺失可以引起水稻耐盐性的显著提供。张安宁等(CN107828794A)提出了通过CRISPR/Cas9技术定向编辑位于OsRR22第1个CDS区的预期靶标位点创制突变体的方法，并筛选出了在0.75％氯化钠浓度胁迫下耐盐性提高的突变体WDR58-cas-1，但该方法仅属于突变体创制方法的初步研究，并未提出一种定向、高效培育强耐盐、强优势水稻新品种的具体方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有水稻耐盐育种技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术、尤其是与杂种优势利用技术相结合，靶向修饰杂交稻骨干亲本耐盐基因OsRR22创制耐盐优异亲本，并定向培育强耐盐、强优势且不含转基因成分的杂交水稻新品种的育种方法。本专利技术具有方向性强、遗传背景改变小、杂种优势明显等特点，并可规避转基因可能带来的风险。为此，本专利技术提供了一种定向、高效培育耐盐水稻品种的育种方法，其基于CRISPR/Cas9基因编辑技术获得耐盐性显著提高的耐盐优异亲本，其特征在于：在亲本材料OsRR22的始密码子ATG后第308至721位即第3个CDS区的序列中，选择SEQIDNO.2所示序列作为特异性靶位点。优选地，获得耐盐性显著提高的耐盐优异亲本植株的具体方法为：(1)构建含所述靶位点序列片段的基因编辑重组载体；(2)将所构建的基因编辑重组载体转入受体亲本水稻愈伤组织中得到转基因植株；(3)筛选上述转基因植株，获得转基因阳性植株；(4)对上述转基因阳性植株进行靶位点扩增、测序，筛选获得靶向发生突变的突变体。优选地，所述基因编辑重组载体是pCRISPR/Cas9重组载体。进一步所述方法包括下述步骤：(5)对上述突变体加代种植后筛选获得不含转基因成分的纯合稳定突变株系；(6)对上述纯合突变株系进行盐胁迫处理筛选获得耐盐性显著提高的突变株系。优选地，其中所述第(6)步中，还包括对其以受体亲本作为母本进行回交2-3代纯化背景，再选择经回交纯化、株叶形态与母本一致的稳定突变株系作为耐盐优良亲本。更进一步，所述方法包括下述步骤：(7)对上述耐盐优良亲本进行杂交配组、耐盐鉴定试验，选育不含转基因成分、强耐盐、强优势的组合作为耐盐杂交稻新品种。其中，所述步骤(3)中通过潮霉素基因分子检测鉴定获得阳性转基因水稻植株。优选地，所述步骤(5)具体为：收获T0代突变植株的种子，继续种植T1代分离群体，通过潮霉素分子检测、靶点扩增测序分析获得靶位点基因型纯合且不含转基因成分的稳定突变植株，加代繁殖成纯合稳定突变株系。优选地，所述步骤(6)具体为：收获T1代不含转基因成分、纯合突变株系的种子，继续播种成苗，于三叶一心期时，放入浓度为0.8％的氯化钠水溶液胁迫处理7d后进行耐盐性评价，筛选获得耐盐性显著提高的耐盐优良亲本。优选地，所述步骤(7)具体为：对耐盐优良亲本进行杂交配组试验，将杂交种和对照品种进行盐胁迫盆栽试验对其生长势进行观察、测定其地上部分的组织中Na+含量和K+/Na+含量比，选育不含转基因成分、强耐盐、强优势的杂交稻新品种。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向突变OsRR22培育耐盐杂交稻优异亲本的方法，一般只需2-3代即可创制耐盐优异亲本，经亲本杂交测配试验和耐盐性状鉴定即可选育强耐盐、强优势杂交稻新品种。大大缩短了育种周期，加快了育种进程，节省了时间和成本。其中本专利技术针对的靶位点序列更为有效，获得的耐盐效果更好，其是以浓度为0.8％的氯化钠水溶液胁迫处理7d鉴定耐盐性效果。2.本专利技术选择的靶位点序列具有脱靶效应低、GC含量适宜诱发突变等优点，且靶位点位于OsRR22的关键功能区域。3.本专利技术可在突变后代中筛选获得不含有转基因成分的耐盐亲本材料，此方法一方面规避了转基因可能带来的安全风险，另一方面与物理诱变、化学诱变等方法相比该方法的方向性强、突变效率更高，并且由于是靶向突变，更有基因组DNA损伤小的优势。4.本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对目标基因进行定点突变，不改变受体亲本材料的遗传背景；而传统方法无论回交、自交多少代都会或多或少的渗入与目的基因紧密连锁的其他基因，导致受体材料遗传背景的改变甚至带入某些不良性状。5.更进一步地，本专利技术还基于CRISPR/Cas9基因编辑技术和杂种优势利用技术紧密结合，以培育强耐盐、强优势杂交稻新品种的方法。这种方法克服了常规耐盐水稻品种耐盐度低、优势不明显的不足，提供了一种全新的更有效的培育强耐盐、强优势杂交稻新品种的方法。附图说明图1是为本专利技术实施例中所获得的22T3-1-4、22T3-1-5、22T3-1-8、22T3-1-6、22T3-1-9的T1代植株潮霉素分子检测结果，其中1-9、10-18、19-27、28-36、37-46分别为22T3-1-4、22T3-1-5、22T3-1-8、22T3-1-6、22T3-1-9T1代植株，N表示阴性对照，P表示阳性对照。图2是本专利技术实施例中所获得耐盐优良亲本的耐盐表型观察结果，其中22T3-1-5-T2、22T3-1-9-T2、CK分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定向、高效培育耐盐水稻品种的育种方法，其基于CRISPR/Cas9基因编辑技术获得耐盐性突体体植株，其特征在于：在受体水稻材料OsRR22的始密码子ATG后第308至721位的第3个CDS区的序列中，选择SEQ ID NO.2所示序列作为特异性靶位点。

【技术特征摘要】
1.一种定向、高效培育耐盐水稻品种的育种方法，其基于CRISPR/Cas9基因编辑技术获得耐盐性突体体植株，其特征在于：在受体水稻材料OsRR22的始密码子ATG后第308至721位的第3个CDS区的序列中，选择SEQIDNO.2所示序列作为特异性靶位点。2.如权利要求1所述的育种方法，其特征在于：获得突体体植株的具体方法为：（1）构建含所述靶位点序列片段的基因编辑重组载体；（2）将所构建的基因编辑重组载体转入受体亲本水稻愈伤组织中得到转基因植株；（3）筛选上述转基因植株，获得转基因阳性植株；（4）对上述转基因阳性植株进行靶位点扩增、测序，筛选获得靶向发生突变的突变体。3.如权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述基因编辑重组载体是pCRISPR/Cas9重组载体。4.如权利要求2所述的育种方法，其特征在于：进一步包括下述步骤：（5）对上述突变体加代种植后筛选获得不含转基因成分的纯合稳定突变株系；（6）对上述纯合突变株系进行盐胁迫处理筛选获得耐盐性显著提高的突变株系，优选地所述第（6）步中，还包括对其以受体亲本作为母本进行回交2-3代纯化背景，再选择经回交纯化、株叶形态与母本一致的稳定突变株系作为耐盐优良亲本。5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于：进一步包括下述步骤：（7）对上述耐盐优良亲本进行杂交配组、耐盐鉴定试验，选育不含转基因成分、强耐盐、强优...

【专利技术属性】
技术研发人员：段美娟，袁定阳，盛夏冰，余东，谭炎宁，孙志忠，袁贵龙，汪雪峰，
申请(专利权)人：湖南农业大学，湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南,43