马铃薯CISR2基因及其在抗低温糖化中的应用制造技术

本发明专利技术提供了马铃薯CISR2基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯“10908‑06”4℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR2基因，并构建超量表达载体，遗传转化鄂马铃薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR2基因能够提高其抗低温糖化的能力。

CISR2 Gene in Potato and Its Application in Low Temperature Glycation Resistance

The invention provides the potato CISR2 gene and its application in low temperature saccharification resistance; through the sequence published in the potato genome database, using the tuber DNA of the low temperature saccharification resistance genotype potato \10908 06\ stored at 4 C for 15 days as a template, the CISR2 gene was cloned, and the overexpression vector was constructed, and the genetic transformation of Etao 3 was carried out to verify the transgene function, and the overexpression was found. The expression of CISR2 gene can improve its ability to resist low temperature glycation.

【技术实现步骤摘要】
马铃薯CISR2基因及其在抗低温糖化中的应用
本专利技术属于分子遗传育种领域，具体的说是马铃薯CISR2基因及其在抗低温糖化中的应用。
技术介绍
马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属草本植物，是继小麦、玉米和水稻之后的第四大粮食作物，在保障粮食安全和促进经济发展方面起重要作用。目前，全球有150多个国家种植马铃薯，分布仅次于玉米，成为第二个分布最广泛的农作物(谢从华，2012)。全球食用马铃薯消费从鲜薯转向增值的马铃薯加工食品，我国是世界上马铃薯第一大生产国，但是马铃薯油炸加工用等专用型品种稀缺，不能满足加工业发展的需要(金黎平等，2003)。在马铃薯加工业中，为了延长加工周期，预防马铃薯块茎发芽、失水皱缩和病害传播，通常贮藏在10℃以下。但是低温会加速淀粉裂解转化为还原糖(葡萄糖和果糖)，即低温糖化。马铃薯油炸产品色泽变异约93％是由还原糖含量决定的(Roeetal.,1990；PritchardandAdam,1994)。在高温油炸加工期间，还原糖和游离的氨基酸进行MailardReaction，使油炸产品色泽加深，且产生对人体有害的致癌物质丙烯酰胺(Friedman,2003；Tarekeetal.,2002；Shepherdetal.,2010)，这是油炸加工业长期以来面临的一大难题。现已有研究发现通过减少块茎中还原糖含量来降低丙烯酰胺的形成是一种有效的途径(Amreinetal.,2003；Biedermann-Bremetal.,2003)。现有技术存在的问题：根据RNA-seq数据及共表达实验筛选出CISR2转录因子，目前，关于CISR2在马铃薯块茎低温糖化代谢过程中的作用并无相关文献报道。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了马铃薯CISR2基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯10908-064℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR2基因，并构建超量表达载体，遗传转化鄂马铃薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR2基因能够提高其抗低温糖化的能力。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：马铃薯RNA-seq分析与低温糖化基因筛选：本专利技术选取了低温糖化抗性基因型“10908-06”和低温糖化敏感基因型“鄂马铃薯3号(E3)”，种植于温室。马铃薯块茎收获后，室温遮光放置10天，选单个薯块重量大于50g、无病虫害和无机械损伤的块茎，分为两份，一份20℃贮藏0d、5d、15d，另一份4℃贮藏5d、15d，分别取样。取样时将块茎去皮切成小块速冻于液氮，保存于-70℃。参照天根生化科技(北京)有限公司(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取上述所取样品的RNA，送于华大基因进行转录组测序(参考CN201510010458.X、CN201010213759.X、CN201610639522.5)。分析低温糖化抗性和敏感基因型贮藏块茎低温应答的表达谱数据，发现CISR2在抗感材料中的表达模式不一致，表达谱数据结果如下表所示(基因的表达量单位为FPKM)。马铃薯CISR2基因，其通过如下步骤克隆得到：(1)引物设计根据马铃薯基因组序列信息(PGSC0003DMG400002620)，用SnapGene2.3.2软件设计扩增该基因CDS序列的引物。(2)RNA提取与反转录参照天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取低温糖化抗性基因型马铃薯10908-064℃贮藏15d后的块茎RNA，根据TOYOBO反转录试剂盒(CodeNo.FSQ-101)进行反转录获得cDNA。(3)PCR反应和克隆载体构建根据合成的引物以上述cDNA为模板PCR扩增CISR2基因，胶回收扩增片段，进行TOPO克隆，菌液检测并测序，测序正确后命名为TOPO-CISR2。马铃薯CISR2基因在抗低温糖化中的应用，其功能验证方法包括如下步骤：(1)植物表达载体构建将TOPO-CISR2质粒与超量表达载体pJCV55进行LR反应，随后转化大肠杆菌，PCR检测，测序。测序正确的目标载体命名为pJCV55-CISR2。(2)马铃薯遗传转化将pJCV55-CISR2植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404中，参照Sihuaijun等(2003)的方法进行遗传转化。(3)抗低温糖化功能验证将获得的转基因株系及对照E3试管苗种植于温室，薯块收获后，将鲜重大于50g的块茎分别于4℃贮藏30d，然后取样测定CISR2的相对表达量、还原糖含量(RScontent)、蔗糖含量(Succontent)及酸性转化酶活性(VIactivity)，上述测定采用张迟2007的方法。附图说明图1为4℃贮藏30d转基因块茎中CISR2基因的相对表达量；图2为4℃贮藏30d转基因块茎中还原糖及蔗糖含量；图3为4℃贮藏30d转基因块茎中转化酶活性。具体实施方式为使专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1该实施例提供马铃薯CISR2基因及其克隆方法，具体包括如下步骤：(1)引物设计本专利技术中的CISR2基因根据马铃薯基因组数据库公布的序列(PGSC0003DMG400002620)设计引物扩增该基因的CDS全长序列，引物序列如下：CISR1F(5’-CCACATGGCGGAAGTTGAAGTACA-3’)CISR1R(5’-TCAACAAGCCCATTTCAGTG-3’)另外设计了CISR2的定量引物，引物序列如下：qCISR1F(5’-CCGCTAGGGCACATGATGTT-3’)qCISR1R(5’-TTTGACAATGGACGAGGCAA-3’)(2)RNA提取与反转录参照天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取低温糖化抗性基因型马铃薯10908-06块茎4℃贮藏15d后的块茎RNA，根据TOYOBO反转录试剂盒(CodeNo.FSQ-101)进行反转录获得cDNA。(3)PCR反应和克隆载体构建通过PCR的方法，以低温糖化抗性基因型马铃薯10908-06为模板，扩增CISR2的CDS序列(741bp)，反应程序为：95℃，30s；95℃，15s；55℃，15s；72℃，30s；33个循环(2-4步)；72℃，10min；4℃forever。胶回收相应目标片段后连接至TOPO载体上，然后转化至大肠杆菌DH5α，挑斑，菌液检测，送往英潍捷基(上海)贸易有限公司测序验证，阳性质粒提取。实施例2该实施例是将实施例1中得到的CISR2基因进行低温糖化抗性验证，具体验证步骤如下：(1)植物表达载体构建将TOPO-CISR2质粒与超量表达载体pJCV55进行LR反应，随后转化大肠杆菌，PCR检测，测序。测序正确的目标载体命名为pJCV55-CISR2，然后该质粒热激转化至农杆菌LBA4404中，菌检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.马铃薯CISR2基因，其特征在于所述CISR2基因CDS序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.马铃薯CISR2基因，其特征在于所述CISR2基因CDS序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的马铃薯CISR2基因，其特征在于，CISR2基因通过如下步骤克隆：(1)引物设计；(2)RNA提取与反转录；(3)PCR反应、克隆载体构建和测序。3.马...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勋，史伟玲，宋波涛，尹旺，沈昱辰，刘腾飞，刘田田，王季春，
申请(专利权)人：西南大学，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50