干扰HSPA13表达的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种干扰HSPA13表达的siRNA及其应用，具体公开了干扰HSPA13表达的siRNA分子，和该siRNA分子作为制备增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物的应用。本发明专利技术采用siRNA分子干扰HSPA13的表达，实现从基因分子水平有效治疗PVR的发生发展，可以避免其他治疗方式带来的风险。

SIRNA interfering with HSPA13 expression and its application

The invention relates to a siRNA interfering with the expression of HSPA13 and its application, in particular to a siRNA molecule interfering with the expression of HSPA13, and the application of the siRNA molecule as a therapeutic drug for preparing proliferative vitreoretinopathy. The invention adopts siRNA molecule to interfere with the expression of HSPA13, realizes the occurrence and development of effective treatment of PVR at the level of gene molecule, and avoids the risk brought by other treatment methods.

【技术实现步骤摘要】
干扰HSPA13表达的siRNA及其应用
本专利技术涉及增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的研究，尤其是涉及干扰HSPA13表达的siRNA及其应用，干扰HSPA13表达的siRNA作为制备增生性玻璃体视网膜病变治疗药物的应用，该siRNA通过干扰HSPA13的表达来抑制或者减轻PVR的症状，延缓其进展。
技术介绍
增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是创伤愈合在视网膜的反应，同时也是最常见的导致裂孔源性视网膜脱离手术失败的原因。PVR也可被视为在玻璃体腔和视网膜表面细胞膜的生长和收缩。这些膜进一步收缩牵拉，可使已成功治疗的视网膜裂孔再张开或产生新的裂孔，黄斑变形，形成牵拉性视网膜脱离。这种非新生物性眼内增殖同PVR或外伤后所产生的增殖一样，仍然是发展中国家最重要的致盲原因。但是目前对PVR的发病机制的研究仍不明确，并且临床上没有有效的治疗药物，仍主要通过手术治疗，进行玻璃体切除，但手术比较复杂，而且手术也不能有效和彻底的解决问题，术后易复发，手术费用昂贵，给患者及家属带来较大的经济负担，因此深入研究PVR的发病机制，寻找有效安全的靶向药物治疗方法，来辅助视网膜脱离手术的成功，对于PVR的治疗具有重要的临床意义和社会价值。上皮-间质化(EMT)被认为是增生性玻璃体视网膜病变最重要的发病机制之一。EMT是指上皮细胞在特定程序中逐步转化为具有间质表型细胞的过程，如失去典型的上皮样形态，而转变为纤维样形态，并失去细胞之间的紧密连接，上皮细胞标记物如ZO-1，E-cad等表达下降，而间质细胞标记物如a-SMA，N-Cadherin，FN等表达增加，细胞的迁移能力增强，EMT的发生发展在许多种纤维化疾病中有着重要的作用。在多种细胞因子的刺激下，视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)发生EMT是PVR的重要病理过程。目前关于PVR的EMT相关机制的研究较为广泛的是TGFβ1信号通路。TGFβ1被认为是引起PVR最重要的纤维化因子，在PVR患者的视网膜下积液、玻璃体以及增殖膜中都高表达。TGFβ1信号通路包括经典的Smad信号通路和非经典的MAPK信号通路。在经典的TGFβ-Smad信号通路中，TGFβ与I型受体结合，通过磷酸化Smad2和Smad3，再与Smad4结合形成复合体并转运到细胞核中，从而达到调控细胞转录因子的作用。而非经典的MAPK通路包含p38MAPK，c-JNK和p42/44ERK。在临床和基础研究领域，已有关于如何有效治疗PVR的大量文献报道，但目前为止，还没有涉及到关于热休克蛋白70超家族成员HSPA13在PVR治疗中的研究报道。热休克蛋白是细胞稳态的关键调控因子，其细胞保护作用已经得到了广泛的研究。应激与分子伴侣蛋白(Stressandchaperone，STCH)，也称HSPA13，为热休克蛋白家族70的成员之一。1994年该基因被科学家克隆出来并将其定位在人类染色体21q11.1。它编码一个60kD大小的蛋白。目前证明HSPA13在内质网腔内，但缺少一个一致性的羧基端的驻留序列，这是该基因的亚细胞结构定位；应激与热休克蛋白的N末端含有特有的疏水前导序列，该序列由22个氨基酸残基构成，但是与其他热休克蛋白不同的是它缺少羧基端肽的结合域。这种独特的结构使它与其它HSP70家族所不同的是HSPA13对热刺激无应激反应，却被钙离子应激诱导。目前体内和体外实验证据都表明，EMT在乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等多种癌症的原发性浸润和继发性转移中起着举足轻重的作用。之前的研究报道证实HSPA13基因在肝癌、鳞状头颈癌和胃癌中高表达，但是现有技术中并没有研究HSPA13是否与上皮细胞的EMT过程有关。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种干扰HSPA13基因的siRNA及其应用。本专利技术探讨了HSPA13在PVR中的作用，而进一步阐明PVR的机制，并提供一种PVR治疗的有效药物。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术提供一种干扰HSPA13表达的siRNA分子，所述siRNA分子具有SEQIDNO.17所示的序列，即GGCUGACGUCUUCCACGUC。所述siRNA分子与空载质粒(比如空载质粒pSuper)合成得到，即质粒HSPA13siRNA。所述干扰HSPA13表达的siRNA分子作为制备增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物的应用。进一步地，所述siRNA分子作为制备抑制EMT过程药物的应用。进一步地，所述的siRNA分子作为制备抑制TGFβ1引起的EMT相关基因表达的药物的应用。进一步地，所述的siRNA分子作为制备保护EMT引起的细胞紧密连接的破环的药物的应用。进一步地，siRNA分子作为增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物、作为抑制PVR的药物和降低p-ERK1/2和ERK1/2的表达的药物的依据。本专利技术还提供所述干扰HSPA13表达的siRNA分子作为制备抑制TGFβ1诱导的ARPE19细胞迁移的治疗药物的应用。本专利技术还提供一种增生性玻璃体视网膜病变的预防或治疗药物，主要成分为siRNA分子。本专利技术还提供一种抑制EMT过程的药物，主要成分为siRNA分子。本专利技术发现在体外TGFβ1诱导的EMT细胞模型中，干扰HSPA13的表达能够有效地抑制PVR。在体外细胞模型中，本专利技术通过转染HSPA13siRNA，然后10ng/ml的TGFβ1处理细胞，使RPE细胞发生EMT，可以降低EMT相关基因a-SMA、N-Cadherin和Fibronectin的表达，而升高上皮相关基因ZO-1等的表达，同时还能降低细胞迁移率。并且通过使用慢病毒感染细胞，使细胞内HSPA13的表达显著降低，通过流式筛选获得稳定转染的细胞株。利用免疫荧光染色，观察并检测与EMT相关基因FN1的表达水平及细胞定位。本专利技术发现在体外的细胞模型中，干扰HSPA13的表达能够抑制ARPE19细胞发生EMT过程模拟的PVR过程。本专利技术揭示了在PVR的发病过程中，HSPA13扮演了重要的角色。本专利技术提供了通过降低HSPA13的表达水平进行PVR治疗的新策略。本专利技术首次发现了HSPA13与EMT的关系，并通过基础的机制研究，明确了HSPA13在PVR发病机制的作用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)目前PVR的治疗仍以手术为主，但是手术并发症较多并且费用昂贵；而干扰HSPA13的表达思路新颖，并且减少PVR的复发；(2)PVR的治疗目前主要有手术玻璃体切除、非甾体类消炎药、抑制细胞增生的药物、基因治疗等，药物治疗的应用证据还不是很充分，而基因治疗可以从基因分子水平有效治疗PVR的发生发展，可以避免其他治疗方式带来的风险。附图说明图1：荧光定量PCR检测显示，在mRNA水平，TGFβ1引起RPE细胞中HSPA13和其他EMT相关基因的表达量的变化；图2：Westernblot检测显示，在蛋白水平，TGFβ1引起RPE细胞中HSPA13和其他EMT相关基因的表达量的变化；图3：免疫荧光显示，TGFβ1引起HSPA13蛋白的定位改变以及表达量的变化；图4：荧光定量PCR检测显示，在mRNA水平，干扰HSPA13的表达可以通过ERK1/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干扰HSPA13表达的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子具有SEQ ID NO.17所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种干扰HSPA13表达的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子具有SEQIDNO.17所示的序列。2.一种如权利要求1所述干扰HSPA13表达的siRNA分子作为制备增生性玻璃体视网膜病变的治疗药物的应用。3.一种如权利要求1所述干扰HSPA13表达的siRNA分子作为制备抑制EMT过程药物的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的siRNA分子作为制备抑制TGFβ1引起的EMT相关基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕立夏，徐国彤，李梦雯，王娟，张介平，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31