一种甘蔗原生质体电融合的方法技术

本发明专利技术属于植物体细胞杂交技术领域，具体涉及一种甘蔗原生质体电融合的方法，包括以下步骤：(1)亲本原生质体的制备；(2)原生质体的钝化；(3)原生质体融合诱导物的添加：将植物凝集结合到其中一种亲本原生质体的表面，将生物素结合到另一种亲本原生质体的表面；(4)原生质体的融合。本发明专利技术利用植物凝集素可以和生物素结合的原理，分别将植物凝集和生物素结合到在两种亲本原生质体的表面，两种亲本原生质体在植物凝集素可以和生物素的诱导下融合，从而达到提高一对一融合率的作用，杂交后代同时具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因。

A Method of Electrofusion of Sugarcane Protoplasts

The invention belongs to the technical field of plant somatic cell hybridization, and specifically relates to a method for electrofusion of sugarcane protoplasts, including the following steps: (1) preparation of parent protoplasts; (2) passivation of protoplasts; (3) addition of protoplast fusion inducers: binding plant aggregation to the surface of one parent protoplast and binding biotin to another parent protoplast. Surface; (4) protoplast fusion. According to the principle that plant agglutinin can bind to biotin, plant agglutinin and biotin can be combined to the surface of two parent protoplasts respectively. The two parent protoplasts can be fused under the induction of plant agglutinin and biotin, thereby improving the one-to-one fusion rate. The hybrid offspring also have ROC22 sugarcane genes with high yield, high sugar content and high drought tolerance. At the same time, GT28 sugarcane had a high sugar and cold tolerance gene.

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗原生质体电融合的方法
本专利技术属于植物体细胞杂交
，具体涉及一种甘蔗原生质体电融合的方法。
技术介绍
植物原生质体包括细胞核、细胞质和细胞膜，是指除去植物细胞壁后得到的有活力的部分。在适合的培养条件下，离体的植物原生质体能够繁殖分化再生成完整的植株。因去掉了细胞壁的保护，细胞膜的流动性能够得以完整的体现，通过植物原生质体融合而进行的植物体细胞杂交育种技术正是依赖于细胞膜的流动性。而且这种育种方法可以缩短育种年限，还可以克服远缘杂交不亲和的障碍。所以植物体细胞杂交育种技术一直是近些年的研究热点，在品种改良中具有广阔的应用前景，为杂交育种带来了无限的可能。广西作为全中国的甘蔗产量第一大省，是中国最大的甘蔗生产基地，为中国糖料生产做积累和储备。随着生活和社会需求，需要更多的糖料储备，就需要我们提高制糖工业，首要的前提就是甘蔗的产量质量要有质的提高。然而，广西目前还未能培育出高糖高产量，同时又具有抗逆性强的甘蔗品种。新台糖22号是广西甘蔗的当家品种，具有高萌芽率、高分蘖率、高产高糖、高耐旱性等特点的种植性状，但这个品种的耐寒性差，而桂糖28号具有高糖耐寒、抗逆性强、适应性广等特性，研发一种集以上两个甘蔗品种的优良基因于一身的新品种很有必要，目前鲜少有看到甘蔗体细胞融合成功的实验案例。目前，细胞融合虽然取得了一些实质性的成就，但是如何提高一对一融合率仍是努力研究的方向。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种甘蔗原生质体电融合的方法，该方法具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种甘蔗原生质体电融合的方法，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用植物凝集素处理，另一种则用生物素处理，其中，用植物凝集素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取浓度为2-5g/L的植物凝集素，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于装有植物凝集素的容器中5-10s后取出，得到ROC22甘蔗原生质体IV或GT28甘蔗原生质体IV；用生物素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取多巴胺和生物素，并混合溶解于Tris-HCl缓冲液中，得到混合液，其中，所述混合液中多巴胺的浓度为1-3g/L，生物素的浓度为2-4g/L，接着将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于混合液中5-10s，得到ROC22甘蔗原生质体V或GT28甘蔗原生质体V；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的ROC22甘蔗原生质体V和GT28甘蔗原生质体V等体积混合后放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5-0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5-5.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27-33min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液后，用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2-3次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5-5.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35-45r/min的转速酶解3-4h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集沉淀物分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I。在本专利技术中，进一步的说明，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过60-80目筛和180-200目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以450-550r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为4-6min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入3-5份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为4-6min，离心速度为450-550r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2-3次。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(2)所述洗涤的方法为：将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为750-850r/min，离心时间为4-6min。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(3)所述Tris-HCl缓冲液中含6-12g/ml的NaCl和0.1-0.3g/ml的KCl。在本专利技术中，进一步的说明，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8-9。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(4)中，在进行电融合前，先使混合后的ROC22甘蔗原生质体IV和GT28甘蔗原生质体IV在融合液中预平衡3-4min。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用，具体原理为:植物凝集素通过结合细胞表面上的糖蛋白从而附着原生质体的表面，生物素在多巴胺介导下在Tris-HCl缓冲液体系中结合到原生质体表面，利用植物凝集素可以和生物素结合的原理，将植物凝集结合到其中一种亲本原生质体的表面，将生物素结合到另一种亲本原生质体的表面，两种亲本原生质体在植物凝集素可以和生物素的诱导下融合，从而达到提高一对一融合率的作用，杂交后代具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因。试验结果显示，采用本专利技术的方法ROC22甘蔗和GT28甘蔗的原生质体一对一融合率高达31.56％，相比于原生质体不用植物凝集素可以和生物素的对照组高出14.79％。【具体实施方式】本专利技术提供了提供一种甘蔗原生质体电融合的方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术提供的甘本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗原生质体电融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5‑7mmol/L的IOA溶液中17‑22min，另一种于室温下悬浮于45‑55μg/mL的R‑6G溶液中17‑22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105‑6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用植物凝集素处理，另一种则用生物素处理，其中，用植物凝集素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取浓度为2‑5g/L的植物凝集素，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于装有植物凝集素的容器中5‑10s后取出，得到ROC22甘蔗原生质体IV或GT28甘蔗原生质体IV；用生物素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取多巴胺和生物素，并混合溶解于Tris‑HCl缓冲液中，得到混合液，其中，所述混合液中多巴胺的浓度为1‑3g/L，生物素的浓度为2‑4g/L，接着将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于混合液中5‑10s，得到ROC22甘蔗原生质体V或GT28甘蔗原生质体V；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的ROC22甘蔗原生质体V和GT28甘蔗原生质体V等体积混合后放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150‑250V·cm‑1、交流频率为450‑650kHz、持续时间100‑300s、直流脉冲场强为1.5‑2.5kV·cm‑1、脉冲宽度为30‑50μs以及脉冲次数1‑3个。...

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗原生质体电融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用植物凝集素处理，另一种则用生物素处理，其中，用植物凝集素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取浓度为2-5g/L的植物凝集素，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于装有植物凝集素的容器中5-10s后取出，得到ROC22甘蔗原生质体IV或GT28甘蔗原生质体IV；用生物素处理ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III的方法为：取多巴胺和生物素，并混合溶解于Tris-HCl缓冲液中，得到混合液，其中，所述混合液中多巴胺的浓度为1-3g/L，生物素的浓度为2-4g/L，接着将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于混合液中5-10s，得到ROC22甘蔗原生质体V或GT28甘蔗原生质体V；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的ROC22甘蔗原生质体V和GT28甘蔗原生质体V等体积混合后放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个。2.根据权利要求1所述的一种甘蔗原生质体电融合的方法，其特征在于：步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李素丽，宋亚妮，刘芳君，龙安四，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45