一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法技术

本发明专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，所述方法为：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型表达水平下降。本发明专利技术所述方法通过提高细胞中PCBP1蛋白的表达水平，进而调控细胞内人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，减少STAT3的α亚型的表达，抑制STAT3α亚型mRNA的产生，进而使STAT3α蛋白表达水平下降，达到抑制肿瘤细胞生长和抗肿瘤的效果，本发明专利技术所述方法为开发抑制STAT3的药物提供了新的思路，为肿瘤治疗提供新的方法。

A method of inhibiting the expression of alpha subtype of human oncogene STAT3

The invention belongs to the field of biotechnology and medicine, and specifically relates to a method for inhibiting the expression of alpha subtype of human oncogene STAT3. The method is as follows: by increasing the expression level of PCBP1 protein in cells, the variable splicing of exon 23 of human oncogene STAT3 can be regulated to inhibit the production of alpha subtype of STAT3, thereby reducing the expression level of alpha subtype of STAT3. The method of the invention can regulate the variable splicing of exon 23 of human oncogene STAT3 in cells by increasing the expression level of PCBP1 protein in cells, reduce the expression of alpha subtype of STAT3, inhibit the production of alpha subtype of STAT3, and then decrease the expression level of STAT3 alpha protein, so as to achieve the effect of inhibiting the growth of tumor cells and anti-tumor. The method of the invention is to develop the method of inhibiting STAT3. Drugs provide new ideas and new methods for cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法
本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法。
技术介绍
STAT3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3，STAT3)属于信号转导与转录激活因子STAT家族，是重要的癌基因，在控制细胞的生长、分化、增殖、恶性转化和凋亡中有重要的作用。STAT3磷酸化后被激活，可以进入细胞核，并启动促进肿瘤发生发展的靶基因如CyclinD1、survivin、Myc和Bcl-XL的表达。细胞中STAT3蛋白的表达提高后一般也伴随着STAT3磷酸化和活化水平增高。STAT3在很多癌症中高表达，与患者的不良预后有密切关系。经过多年的大量研究，学者们探索制备各种抑制剂来抑制STAT3的表达和功能，但迄今为止临床上仍没有可以应用的抑制STAT3的药物来治疗癌症。STAT3的表达与它的RNA可变剪接有密切的关系。STAT3的基因包括24个外显子，其中第23个外显子的5端剪接位点是可变的，分别产生较长的α亚型(称为STAT3α)和较短的β亚型(称为STAT3β)mRNA(图1)。外显子23的序列在人和小鼠中高度保守，完全相同的碱基为98％，所对应的氨基酸则完全一致，也都有可变剪接。STAT3α编码全长的共770个氨基酸的STAT3蛋白。但STAT3β由于剪接后，阅读框架产生改变，使第715个后的氨基酸发生改变，并产生了一个终止密码子，最终产生的STAT3蛋白为722个氨基酸。STAT3蛋白主要有4个功能结构域：DNA结合区(DNA-bindingdomain,DBD)、SH2结构域、酪氨酸磷酸化位点结构域和羧基端转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain,TAD)。与STAT3全长蛋白(以下称为STAT3α蛋白)相比，STAT3β编码的较短的STAT3蛋白(以下称为STAT3β蛋白)缺乏羧基端的转录激活结构域。研究表明STAT3α蛋白是原癌基因，在肿瘤中高表达，促进肿瘤的发生和发展。而STAT3β蛋白则相反，在肿瘤中起了抑癌基因的作用(图1)。在肿瘤细胞中表达的主要是STAT3α，STAT3β蛋白则很不易检测到。Niu等发现在恶性黑色素瘤细胞中过表达STAT3β后，诱导了肿瘤细胞发生凋亡，抑制了肿瘤生长和引起了肿瘤退缩。Zammarch等进一步发现，在裸鼠上接种恶性黑色素瘤细胞形成肿瘤后，用反义寡核苷酸抑制STAT3α的剪接并促进STAT3β的表达，可以显著促进肿瘤的退缩。因此，采用适当的方法使STAT3前体mRNA外显子23剪接时增加STAT3β，同时减少STAT3α亚型的表达，以抑制促癌的STAT3α的表达，可能为肿瘤治疗提供新的方法。目前关于STAT3的外显子23的可变剪接的调控机制还不清楚。PCBP1，也称为hnRNPE1，属于hnRNP家族，能与RNA的多聚胞嘧啶区域[poly(rC)]活性区域特异性结合，调控RNA可变剪接、稳定性和翻译等。PCBP1基因在进化中高度保守。很多研究都表明PCBP1在癌症组织中主要是低表达，如肺癌、甲状腺癌和宫颈癌等。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，目的在于提供一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，具体包括：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型蛋白表达水平下降。按上述方案，所述人癌基因STAT3外显子23中包含抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的序列，所述PCBP1蛋白能与该序列结合从而抑制人癌基因STAT3的α亚型表达。按上述方案，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的编码序列，将编码序列克隆到载体中形成重组质粒并转染细胞，增加PCBP1蛋白在细胞中的表达水平。按上述方案，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的编码序列，然后与T7短肽的编码序列连接组成能编码T7短肽和PCBP1融合蛋白的基因片段，将基因片段克隆到载体中形成重组质粒并转染细胞，增加PCBP1蛋白在细胞中的表达水平。按上述方案，所述载体为慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体或其它真核表达载体。本专利技术的有益效果如下：本专利技术所述方法通过提高细胞中PCBP1蛋白的表达水平，进而调控细胞内人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，减少STAT3的α亚型(STAT3α)的表达，抑制STAT3α亚型mRNA的产生，进而使STAT3α蛋白表达水平下降，达到抑制肿瘤细胞生长和抗肿瘤的效果，本专利技术所述方法为开发抑制STAT3的药物提供了新的思路，为肿瘤治疗提供新的方法。附图说明图1为STAT3前体mRNA的可变剪接；方框表示外显子，方框间的实线表示内含子。内含子上方的虚线表示RNA剪接的方向，STOP表示终止密码子。图2(A)为STAT3mini基因表达质粒模式图；将人STAT3的外显子22、内含子22和外显子23的基因组序列克隆到pEGFP-N1质粒中CMV启动子后，并对外显子23的5端的序列进行了系列突变。(B)用STAT3特异性引物和载体质粒上的特异性引物，以RT-PCR检测外显子23的可变剪接，GAPDH是上样量的对照，右侧是RNA剪接和PCR产物的模式图，外显子上或下的短横表示PCR使用的上下游引物。图3为RNA剪接调控因子PCBP1促进STAT3β亚型的表达，其中(A)是将图所标的RNA剪接调控因子表达质粒(pEGFP-N1是对照)转染293细胞，24小时后提取总RNA，以STAT3α或STAT3β特异性引物检测STAT3的外显子23的可变剪接，右侧是RNA剪接和PCR产物的模式图，外显子上或下的短横表示PCR使用的上下游引物；(B)Western杂交检测PCBP1的过表达，T7-PCBP1是质粒编码的与T7标签短肽融合的PCBP1蛋白，PCBP1抗体来自Origene公司。图4为PCBP1与STAT3外显子4的序列可以结合；其中(A)为合成生物素标记的RNA寡核苷酸，mt4是STAT3外显子23上经突变序列，wt4是未突变的序列，PCBP1+是根据文献确定的能与PCBP1结合的RNA序列，作为阳性对照；(B)为RNApulldown实验检测PCBP1与靶RNA序列的结合，用westerner杂交的方法检测PCBP1与RNA的结合，“细胞裂解物”是western杂交的阳性对照，检测“Pulldown实验后的细胞裂解物”是为了证明所加入的细胞总蛋白中的PCBP1结合到RNA上后留在琼脂糖珠上，总蛋白中剩余的PCBP1的量减少了。图5为过表达PCBP1降低了STAT3α/STAT3β的比例，并抑制SCC-9的生长，其中(A)将表达PCBP1蛋白的慢病毒转染SCC-9细胞，提取总RNA和总蛋白，以RT-PCR检测外显子23的可变剪接，GADPH是上样量对照；(B)Western杂交验证PCBP1的过表达以及STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平，T7-PCBP1是质粒编码的与T7标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型蛋白表达水平下降。

【技术特征摘要】
1.一种抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于：通过增加PCBP1蛋白在细胞内的表达水平，从而调控人癌基因STAT3外显子23的可变剪接，达到抑制STAT3的α亚型mRNA的产生，进而使STAT3的α亚型蛋白表达水平下降。2.根据权利要求1所述的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于，所述人癌基因STAT3外显子23中包含抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的序列，所述PCBP1蛋白能与该序列结合从而抑制人癌基因STAT3的α亚型表达。3.根据权利要求1所述的抑制人癌基因STAT3的α亚型表达的方法，其特征在于，从细胞中用PCR方法获得PCBP1基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾荣，郭继华，王晓乐，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42