一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用，涉及细胞免疫治疗技术领域。本发明专利技术公开的嵌合抗原受体NK细胞可同时表达IL‑15和靶向CD19的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体NK细胞对肿瘤细胞具有较好的杀伤效果，可用于制备抗肿瘤药物，为治疗肿瘤提供了一种新的思路和方法。

A chimeric antigen receptor NK cell and its preparation and Application

The invention discloses a chimeric antigen receptor NK cell, a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of cellular immunotherapy. The chimeric antigen receptor NK cell disclosed by the invention can simultaneously express IL_15 and chimeric antigen receptor targeting CD19. The chimeric antigen receptor NK cell has good killing effect on tumor cells and can be used to prepare antineoplastic drugs, thus providing a new idea and method for the treatment of tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体NK细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
2017年7月，FDA肿瘤药物专家咨询委员会全票通过并批准诺华CAR-T疗法CTL-019上市，这无疑是人类在抗争肿瘤疾病路途中极具里程碑意义的事件，同时再一次将CAR-T推到“风口浪尖”。CTL019作为第一个被批准上市的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)产品，标志着肿瘤免疫疗法新时代的到来。CAR-T给广大的肿瘤患者带来希望的同时也带来许多治疗风险。目前CAR-T治疗中的脱靶效应、细胞因子风暴、T细胞分离纯化困难以及感染效率低下、移植物抗宿主反应、制备周期长等问题还等待着我们去解决。但目前，仅经CAR单一修饰的效应细胞其杀伤肿瘤细胞的效果仍然有待进一步提高。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种嵌合抗原受体NK细胞，该嵌合抗原受体NK细胞可同时表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有较好的杀伤效果，可用于制备抗肿瘤药物。本专利技术的另一目的在于提供一种制备方法，采用该方法可以制备得到表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体NK细胞，用于治疗肿瘤。本专利技术的目的在于提供上述嵌合抗原受体NK细胞的应用。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体NK细胞，所述细胞表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。IL-15是一类重要的促炎症因子，在机体固有免疫中发挥着重要的调控作用。IL-15具有多种生物学功能，是机体重要的促炎症因子,主要表现为:1、对T细胞的作用：IL-15能够维持T细胞CTLL-2的生长、诱导细胞毒性T细胞活性、增强T细胞早期活化及增殖等；2、对B细胞的作用：IL-15对正常B细胞分化有一定作用、其与CD40L联合作用还可使B细胞分泌IgG；3、对NK细胞的作用IL-15可通过IL-2受体活化NK细胞，引起NK细胞扩增、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用作用和产生细胞因子。CD19表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志。CD19是恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白,在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性,使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。本专利技术首次在表达靶向CD19的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体NK细胞上，通过对嵌合抗原受体NK细胞进一步修饰，使其共表达出IL-15，进而增强其对肿瘤细胞的杀伤效果，提高其抗肿瘤活性，该嵌合抗原受体NK细胞可用于制备相关的抗肿瘤药物，或用于治疗肿瘤。该嵌合抗原受体NK细胞具有功能更强大、来源更方便、使用更安全、成本更低廉的特点。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还具有如下元件：CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域；所述靶向CD19的抗原结合结构域、所述CD8α跨膜结构域、所述4-1BB共刺激信号传导区和所述CD3ζ信号传导结构域依次连接。当然，需要说明的是，针对本专利技术提供的嵌合抗原受体NK细胞所表达的靶向CD19的嵌合抗原受体，其跨膜结构域还可以是DAP10或PD1，共刺激信号传导区还可以是CD28、CD137或CD134。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述靶向CD19的抗原结合结构域为靶向CD19的单链抗体scFv。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述靶向CD19的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述IL-15的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；优选的，所述4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；优选的，所述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。另一方面，本专利技术提供了上述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其包括：将表达靶向CD19的嵌合抗原受体和IL-15的表达盒转入宿主细胞；所述宿主细胞为NK细胞。其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。当然，需要说明的是，在其他的一些实施例中，宿主细胞也可以是T细胞、巨噬细胞、B细胞、NKT细胞、CIK细胞或DC-CIK细胞。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述表达盒中，表达靶向CD19的嵌合抗原受体的核苷酸序列与表达IL-15的核苷酸序列之间通过IRES序列连接。再一方面，本专利技术提供了上述的嵌合抗原受体NK细胞在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述肿瘤为B细胞淋巴瘤。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为共表达IL-15和靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的各表达原件的结构示意图。图2为流式细胞仪检测阳性细胞百分比的结果。图3为不同效靶比的阳性CD19-CAR-IL15-NK92细胞对B细胞淋巴瘤Raji细胞的杀伤效果。图4为CD19-CAR-IL15-NK92细胞的颗粒酶B的检测结果。图5为pCDH载体的结构示意图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例制备共表达IL-15的靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体NK细胞1慢病毒包装质粒的构建具有靶向CD19胞外段的单链抗体scFv氨基序列如SEQIDNO.1所示。将靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列通过IRES与IL-15的核苷酸序列相连，得到共表达核酸序列SEQIDNO.7，将SEQIDNO.7克隆至pCDH载体(结构见图5)，酶切位点是SalI和XbaI上。各表达元件的结构位置关系如图1所示。靶向CD19胞外段的嵌合抗原受体的核苷酸序列依次包括：单链抗体scFv、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。其中，IL-15为人的IL-15，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，相应的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。采用用PCR方法从cDNA中扩增出IL-15基因；用Xbal单酶切实验室质粒PCDH-CD19-CAR2；接着用一步克隆法连接IL-15和载体，得到质粒PCDH-CD19-CAR2-IRES-IL15。得到的包装质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述细胞表达IL‑15和靶向CD19的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述细胞表达IL-15和靶向CD19的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有靶向CD19的抗原结合结构域。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有如下元件：CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域；所述靶向CD19的抗原结合结构域、所述CD8α跨膜结构域、所述4-1BB共刺激信号传导区和所述CD3ζ信号传导结构域依次连接。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述靶向CD19的抗原结合结构域为靶向CD19的单链抗体scFv。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述靶向CD19的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述IL-15的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：江文正，牛聪义，韦欢，李贞龙，刘明耀，席在喜，
申请(专利权)人：华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31