一种羊痘灭活疫苗及其生产方法技术

技术编号:20117272 阅读:81 留言:0更新日期:2019-01-16 11:58
本发明专利技术涉及一种羊痘灭活疫苗及其制备方法。本发明专利技术采用山羊痘病毒AV41株接种BHK‑21细胞,收获培养物,经浓缩、纯化、BEI灭活后,按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和绵羊痘。采用本发明专利技术提出的悬浮培养BHK‑21细胞生产羊痘灭活疫苗,较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势,即解决了目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难的问题,又避免了原代细胞携带外源病毒的生物安全风险,且所制备的疫苗不存在羊痘活疫苗易引起羔羊死亡、母羊流产等安全隐患。此外,本疫苗可经颈部皮下或肌肉注射免疫,解决了羊痘活疫苗需皮内免疫,在临床使用过程中难以操作的难题。

An inactivated sheep pox vaccine and its production method

The invention relates to an inactivated sheep pox vaccine and a preparation method thereof. The method adopts goat pox virus AV41 strain to inoculate BHK_21 cells, harvest culture, concentrate, purify, BEI inactivate, and add appropriate adjuvant mixed emulsification in a certain proportion. It is used to prevent goat pox and sheep pox. The production of inactivated sheep pox vaccine by suspension culture of BHK 21 cells has obvious advantages over the live vaccine prepared by original sheep testicular cells, which not only solves the problem of difficult origin of sheep testis in the production of live sheep pox vaccine, but also avoids the biological safety risk of carrying exogenous virus in primary cells, and the prepared vaccine does not contain live sheep pox vaccine. It is easy to cause lamb death and ewe abortion. In addition, the vaccine can be subcutaneously or intramuscularly injected into the neck to solve the intradermal immunization of live sheep pox vaccine, which is difficult to operate in clinical use.

【技术实现步骤摘要】
一种羊痘灭活疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种羊痘灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
养羊业与国民经济的发展和人民生活水平的提高关系十分密切,特别是进入21世纪后,我国养羊业得到快速发展,成果显著,养羊业在国民经济中的比重也逐年提高。根据联合国粮农组织(FAO)数据,2013年,中国大陆地区的绵羊养殖量即达1.91亿头,山羊1.83亿头,合计3.74亿头。2014年,中国大陆地区的绵羊养殖量为2.02亿头,山羊1.88亿头,合计3.90亿头。虽然我国养羊数量位居世界首位,但与养羊业发达的国家相比,疫病防控水平较薄弱,这在一定程序上制约了我国养羊业的发展。羊痘是世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的传染病之一,羊痘病毒(Capripoxviruses)属于痘病毒科山羊痘病毒属。羊痘是由绵羊痘和山羊痘引起的一种接触性传染病,呈流行性。它的特征是在全身皮肤、粘膜上出现典型的痘疹,病羊发热并有较高的死亡率,其中羔羊的发病致死率可高达100%,妊娠母羊常发生流产。本病主要通过呼吸道感染,在冬末春初流行,大多数绵羊山羊生产国均有流行。非洲、亚洲大部分国家报道该病的发生。这些疫病一旦发生,病情迅猛,传播性强,死亡率高,损失极大,国际上始终都对这类烈性疫病高度重视,严加防范。我国近3年的羊痘疫情时有发生,给我国养羊业造成重大损失。目前,我国羊群中羊痘感染的状况仍非常普遍,疫苗免疫是我国防控羊痘的主要手段。目前我国广泛应用的山羊痘活疫苗,经过长期的临床实践检验,发现还存在如下3项主要不足,一是生产种毒存在一定的残余毒力,易引起羔羊死亡、母羊流产,存在较大的安全隐患;二是需采用原代绵羊睾丸细胞制备疫苗,生产过程中面临绵羊睾丸来源困难的问题,且存在原代细胞携带外源病毒的生物安全风险;三是需皮内免疫,在临床使用过程中难以操作。本专利技术提出的悬浮培养BHK-21细胞生产羊痘灭活疫苗,较原羊痘活疫苗具有明显的优势,即解决了目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难的问题,又避免了原代细胞携带外源病毒的生物安全风险,且所制备的疫苗不存在引起羔羊死亡、母羊流产等安全隐患。此外,本疫苗可经颈部皮下或肌肉注射免疫,解决了羊痘活疫苗需皮内免疫,在临床使用过程中难以操作的难题。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出采用BHK-21细胞悬浮培养工艺生产的羊痘灭活疫苗,用于预防山羊痘和绵羊痘。本专利技术技术方案1.一种羊痘灭活疫苗,其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原。2.本专利技术所述羊痘灭活疫苗,其特征在于所述羊痘抗原生产毒株为山羊痘病毒AV41株。3.本专利技术所述羊痘灭活疫苗,其特征在于所述生产用BHK-21细胞采用纯悬浮培养工艺,培养过程中无需添加载体。4.本专利技术所述羊痘灭活疫苗的制备方法,其特征在于用所述山羊痘病毒AV41株作为疫苗生产毒株,接种BHK-21细胞,收获培养物,经浓缩、纯化、BEI灭活后,按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成羊痘灭活疫苗,用于预防山羊痘和绵羊痘。本专利技术具体实施方式1.羊痘灭活疫苗的制备(1)生产和检验用毒种生产用毒种为山羊痘病毒AV41株,检验用毒种为山羊痘病毒AV40株,均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著,中国兽医菌种目录(第二版),中国农业科学技术出版社,2002年,p150)。(2)生产用细胞制备从液氮罐中取出BHK-21细胞,迅速置36~37℃水浴解冻,转入装有MEM培养液的无菌离心管中,以800r/min离心5min,用含2%血清的MEM培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶,置37℃恒温振荡培养箱中,以160~200r/min振荡培养,当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时,将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器,并采用同样方法逐级放大到二级反应器,反应器搅拌速度为60~100r/min,溶氧(DO)40%~60%,pH值7.0~7.4,温度为36~37℃,培养48~72小时。(3)生产用毒种制备当生物反应器细胞密度达2×106个/ml以上、活率90%以上时,按2%~8%的比例接种病毒液,调整反应器搅拌速度为60~100r/min,溶氧(DO)40%~60%,pH值7.0~7.4,36~37℃培养,定时取样观察细胞病变,当细胞活率低于20%时收获培养物,注明毒种名称、批号、代次、收获日期,置-20℃以下保存,作为生产用悬浮细胞毒种。(4)制苗用病毒液的制备当生物反应器内细胞密度达到2×106个/ml以上时,按2%~8%的比例接种AV41株悬浮细胞毒。接种后,调整反应器搅拌速度为60~100r/min,溶氧(DO)40%~60%,pH值7.0~7.4,36~37℃悬浮培养,定时取样观察,若48~72小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎,活率低于20%时停止培养,收获培养物。将收获的病毒液经1.0μm的滤芯过滤后,采用30万截留分子量(MW)超滤浓缩系统浓缩10倍(v/v),用PBS(0.01mol/L,pH值7.2)将浓缩后的病毒液稀释至原体积,即为制苗用病毒液。(5)灭活将BEA粉加入已灭菌的0.2mol/L的氢氧化钠溶液中,充分溶解,使BEA浓度为0.2mol/L,置37℃水浴中,每隔10~15min振摇一次,使BEA充分环化1小时后,终止环化,产生二乙烯亚胺(BEI),最终浓度为0.2mol/L。向检验合格的羊痘病毒液中加入BEI溶液至终浓度为0.004mol/L,升温至30℃时开始计算灭活时间,温度保持在30±1℃,灭活28小时,其间2~4小时搅拌一次,每次10~15min。灭活结束后,立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液,使终浓度为1%,充分搅拌均匀,置2~8℃保存备用。(6)疫苗配制将水相(矿物油佐剂)和油相(山羊痘病毒AV41株灭活病毒液)分别预热到相同温度,再按质量比(水相:油相=1:1)真空进料至乳化罐中,进完料后循环搅拌至水相与油相充分混合,再通过均质机乳化成双相油乳剂疫苗。乳化后取样进行检验,合格后分装。2.羊痘灭活疫苗的检验(1)性状外观淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。剂型水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管,吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面,应呈云雾状扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中,以3000r/min离心15min,管底析出的水相应不超过0.5ml。黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验,应符合规定。(2)装量检查按《中国兽药典》(中国兽药典委员会,中华人民共和国兽药典,二〇一五年版三部,中国农业出版社,2015,以下称《中国兽药典》)附录进行检查,应符合规定。(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。(4)安全检验用3~6月龄的健康易感山羊2只,各颈部两侧肌肉注射疫苗4.0ml,每侧2.0ml,连续观察14日,应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。(5)效力检验选取健康易感山羊7只,其中5只各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml,另2只不接种作为对照。免疫后21日,所有山羊各胸腹侧皮内分两点注射山羊痘强毒AV40株病毒液1.0ml(含103.0ID50),0.5ml/点,连续观察15日。对照山羊应全部发本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种羊痘灭活疫苗,其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK‑21细胞生产的山羊痘病毒抗原。

【技术特征摘要】
1.一种羊痘灭活疫苗,其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原。2.如权利要求1所述羊痘灭活疫苗,其特征在于所述羊痘病毒抗原生产毒株为山羊痘病毒CVCCAV41株。3.如权利要求1所述羊痘灭活疫苗,其特征在于所述生产用BHK-21细胞采...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈小云杜吉革王磊王静文张敏薛麒朱真
申请(专利权)人:中国兽医药品监察所
类型:发明
国别省市:北京,11

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