一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于荧光免疫分析领域，涉及一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法，包括甲胎蛋白、AFP捕获抗体、AFP检测一抗、碱性磷酸酶标记的二抗、L‑抗坏血酸磷酸二钠盐、邻苯二胺等。该试剂盒是通过在96孔酶标板上依次吸附捕获抗体、甲胎蛋白和检测一抗形成类似三明治的结构，后续加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与检测一抗结合，最后加入底物L‑抗坏血酸磷酸二钠盐，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下生成抗坏血酸，酶切产物与邻苯二胺发生原位反应生成具有荧光发射的基团，进而实现对甲胎蛋白的定量检测。该试剂盒的检测结果与基于4‑硝基苯磷酸二钠盐的比色ELISA方法相符，可通过荧光激活反应而灵敏检测甲胎蛋白，并最终用于检测肝癌病人血清中甲胎蛋白。

A fluorescence detection kit for alpha-fetoprotein and its detection method

The invention belongs to the field of fluorescence immunoassay, and relates to a fluorescence detection kit for alpha-fetoprotein and a detection method, including alpha-fetoprotein, AFP capture antibody, AFP detection first antibody, alkaline phosphatase labeled second antibody, L_ascorbic acid phosphate disodium salt, o-phenylenediamine, etc. The kit is a sandwich-like structure formed by adsorbing antibodies, alpha-fetoprotein and detecting primary antibodies on 96-well enzyme label plate in turn. The secondary antibodies labeled with alkaline phosphatase are specifically combined with the primary antibody. Finally, the substrate L-ascorbic acid phosphate disodium salt is added to form ascorbic acid under the action of dephosphorylation of alkaline phosphatase, and the digested products are linked with o-phenylenediamine. The fluorescence emission group was generated by in situ reaction, and the quantitative detection of alpha-fetoprotein was realized. The results of this kit are consistent with the colorimetric ELISA method based on 4 nitrophenylphosphate disodium salt. It can sensitively detect alpha-fetoprotein by fluorescence activation reaction and eventually be used to detect alpha-fetoprotein in serum of patients with hepatocellular carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于荧光免疫分析领域，具体涉及一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
酶联免疫吸附分析(ELISA)是将抗原抗体特异性识别作用和酶的生物催化性质相结合，并以酶作为信号输出单元而实现抗原高灵敏检测的技术，是复杂生物基质样品分析中的一个重要的方法。酶广泛地作为免疫分析中的标记物，因为一个酶分子可以在短时间内将大量的酶底物转化成产物，从而发挥信号放大的作用，该信号放大效应为分析物的灵敏检测奠定基础。碱性磷酸酶(ALP)是一种磷酸水解酶，该酶广泛分布于人体组织和体液，以骨、肝、乳腺、小肠、肾中含量较高，其大部分由骨细胞产生，小部分来自肝，经胆汁排入肠道。在碱性环境中，ALP能水解很多磷酸单酯化合物，将底物脱磷酸化。该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，包括骨病，糖尿病，乳腺癌和前列腺癌和肝炎。ALP由于其较高的催化活性、较好的稳定性、易于和抗体偶联等特点，也经常作为ELISA的信号输出酶。与传统的比色ELISA相比，荧光ELISA由于其灵敏度高和背景干扰低，具有较明显的优势，而得到越来越多的关注。生物标志物可客观测定和评价普通生理、病理或治疗过程中的某种特征性，通过对它的测定可以指示不同的疾病导致的致病过程，生物标志物的监测广泛用于基础和临床研究。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。甲胎蛋白(AFP)是肝癌患者血清中的一个重要标志物，正常成年人血清中AFP含量通常低于20ng/mL，甚至低于5ng/mL，而肝癌患者血清中AFP含量异常升高，通常大于400ng/mL。因此，AFP的准确定量对肝癌疾病的诊断和监控具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒及检测方法，该检测方法灵敏度高，具有普适性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒，包括：甲胎蛋白(AFP)，AFP捕获抗体，AFP检测一抗，碱性磷酸酶标记的二抗，包被缓冲液，洗涤液，抗体稀释液，样品稀释液，L-抗坏血酸磷酸二钠盐(AA2P)，邻苯二胺(OPD)，封闭液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液，MgCl2溶液。在上述技术方案中，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。在上述技术方案中，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.05～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。在上述技术方案中，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.05～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-1％牛血清蛋白的缓冲溶液。在上述技术方案中，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。在上述技术方案中，所述的Tris-HCl缓冲液是浓度为50～200mM、pH8.5～9.5的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～2mM。本专利技术还提供一种甲胎蛋白的检测方法，包括以下步骤：步骤一：将AFP捕获抗体用包被稀释液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内液体并用洗涤液清洗，再向孔内加入封闭液，孵育后弃去孔内液体，再用洗涤液清洗，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的AFP标准溶液并进行孵育，接着弃去孔内液体后用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的AFP检测一抗接着进行孵育后，弃去孔内液体后并用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗；步骤二：在孔内加入AA2P溶液，MgCl2溶液，Tris-HCl缓冲溶液，孵育后依次加入OPD溶液，孵育后进行荧光光谱测试。在上述技术方案中，所述甲胎蛋白的检测方法具体包括以下步骤：步骤一：将AFP捕获抗体用包被稀释液稀释200倍，取100μL加入酶标板后在4℃孵育过夜或者室温孵育2.5h，弃去孔内液体并用300μL洗涤液洗3次，在孔内加入200μL封闭液，37℃孵育1h后弃去孔内液体，再用300μL洗涤液洗3次，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的AFP标准溶液并在37℃孵育1h，弃去孔内液体后用300μL洗涤液洗3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的AFP检测一抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次，加入100μL用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育1h后弃去孔内液体后并用洗涤液洗涤3次；步骤二：在孔内加入25μL100mMAA2P溶液，30μLMgCl2溶液，170μLTris-HCl缓冲溶液，37℃孵育50min后依次加入25μL10mMOPD溶液，37℃孵育120min后进行荧光光谱测试。在上述技术方案中，步骤二中的AFP捕获抗体的浓度为10～50μg/mL，AFP检测一抗的浓度为5～20μg/mL，碱性磷酸酶标记的二抗的浓度为0.05～1μg/mL。在上述技术方案中，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液；所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.05～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液；所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.05～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-1％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液；所述的Tris-HCl缓冲液是浓度为50～200mM、pH8.5～9.5的溶液；所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～2mM。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，该试剂盒是基于碱性磷酸酶引发的原位荧光反应检测肝癌标志物AFP，其原理是基于抗原抗体特异性作用和酶的信号放大效应，通过在酶标板上依次吸附捕获抗体、AFP和AFP检测一抗来形成类似三明治的结构，后续加入的碱性磷酸酶标记的二抗特异性地与AFP检测一抗结合，最后加入底物AA2P，在碱性磷酸酶的脱磷酸作用下，AA2P被脱磷酸化生成抗坏血酸(AA)，与后续加入的OPD发生反应生成具有荧光发射的基团，体系的荧光强度与碱性磷酸酶的浓度成正相关，而AFP浓度与碱性磷酸酶浓度正相关，进而实现对AFP的定量检测。碱性磷酸酶作为连接AFP浓度和荧光信号的桥梁，利用碱性磷酸酶引发的荧光反应作为输出信号。将该试剂盒用于正常人和肝癌患者的血清中AFP含量的检测，结果表明该试剂盒的检测结果与基于pNPP的比色ELISA方法相符，该试剂盒可通过荧光激活反应而检测AFP。同时，该方法具有普适性，只需根据不同的靶标抗原更换相应的捕获抗体和检测一抗，就可将其应用拓展到其他癌症标志物的检测。本专利技术提供的AFP检测方法，该方法是以碱性磷酸酶作为ELISA信号输出酶来提供一种荧光的信号输出模式，碱性磷酸酶具有的脱磷酸作用将AA2P转变成AA，然后加入OPD溶液，AA和OPD能发生反应产生具有荧光发射的基团，最终通过荧光激活反应来检测肿瘤标志物AFP。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为本专利技术实施例1基于碱性磷酸酶引发的原位荧光反应检测肝癌标志物AFP的酶联免疫方法示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：甲胎蛋白，AFP捕获抗体，AFP检测一抗，碱性磷酸酶标记的二抗，包被缓冲液，洗涤液，抗体稀释液，样品稀释液，L‑抗坏血酸磷酸二钠盐，邻苯二胺，封闭液，三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液，MgCl2溶液。

【技术特征摘要】
1.一种甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：甲胎蛋白，AFP捕获抗体，AFP检测一抗，碱性磷酸酶标记的二抗，包被缓冲液，洗涤液，抗体稀释液，样品稀释液，L-抗坏血酸磷酸二钠盐，邻苯二胺，封闭液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，MgCl2溶液。2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液是pH＝8.0～9.6的10～100mM碳酸盐溶液。3.根据权利要求1所述的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液是pH＝7.4的含有0.05～0.5％Tween-20和10～100mM磷酸根/磷酸氢根/磷酸二氢根的混合溶液。4.根据权利要求1所述的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的抗体稀释液是pH＝7.4的含有0.05～0.2％Tween-20和0.1-2％牛血清蛋白的缓冲溶液；所述的样品稀释液是含有0.1-1％牛血清蛋白的缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭液是用抗体稀释液溶解的牛血清蛋白浓度为0.1～5％的溶液。6.根据权利要求1所述的甲胎蛋白荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液是浓度为50～200mM、pH8.5～9.5的溶液，所述的MgCl2溶液的浓度是0.25～2mM。7.一种甲胎蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将AFP捕获抗体用包被稀释液稀释后加入酶标板后进行孵育，然后弃去孔内液体并用洗涤液清洗，再向孔内加入封闭液，孵育后弃去孔内液体，再用洗涤液清洗，之后加入不同浓度的用样品稀释液稀释后的甲胎蛋白标准溶液并进行孵育，接着弃去孔内液体后用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的AFP检测一抗接着进行孵育后，弃去孔内液体后并用洗涤液清洗，加入用抗体稀释液稀释后的碱性磷酸酶标记的二抗，孵育后弃去孔内液体后并用洗涤液清洗；步骤二：在孔内加入L-抗坏血酸磷酸二钠盐溶液，MgCl2溶液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，孵育后依次加入邻苯二胺溶液，孵育后进行荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙健，杨秀荣，赵佳会，赵丹，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22