用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法。所述荧光试剂包括化合物A、溶剂B和溶液C；所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。本发明专利技术的荧光试剂，可对口腔中H5N1血凝素蛋白进行检测，不受口腔中的成分的干扰；并且，本发明专利技术所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测。

Fluorescent reagent for detection of influenza virus hemagglutinin protein in oral cavity, its preparation method and detection method

The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to a fluorescent reagent for detecting influenza virus hemagglutinin protein in oral cavity, a preparation method and a detection method thereof. The fluorescent reagent includes compound A, solvent B and solution C; the solvent B includes one or more of dimethyl sulfoxide, acetonitrile and dimethylformamide; the solution C includes water, oral swab solution or oral swab solution containing H5N1 hemagglutinin protein. The fluorescent reagent for detecting influenza virus hemagglutinin protein in oral cavity can be obtained by dissolving compound A in solvent B, adding solution C and mixing evenly. The fluorescent reagent of the invention can detect H5N1 hemagglutinin protein in oral cavity without interference of components in oral cavity; moreover, the fluorescent reagent of the invention has high sensitivity to detect H5N1 hemagglutinin protein, and can quantitatively detect H5N1 hemagglutinin protein with concentration (> 81.5ng/mL).

【技术实现步骤摘要】
用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法
本专利技术涉及生物传感器
，尤其是涉及一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法。
技术介绍
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同分为不同的亚型。其除感染禽外，还可感染人、猪、马等哺乳动物。甲型流感主要病毒类型：H7N9、H1N1、H5N1，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。禽流感诊断试剂是禽流感防控的重要武器，在禽流感防控中发挥着重要作用。通过检测抗原抗体以掌握该疫病的流行状况，为防控做好充分准备。由于技术力量不足和缺乏快速、准确的诊断监测方法，目前我国在禽流感的监测环节仍然比较薄弱，主要依靠政府主导的实验室检测。流感确诊通常有以下几项：1.病毒核酸检测。以RT-PCR法检测呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。2.病毒分离培养。从呼吸道标本中分离出流感病毒。在流感流行季节，流感样病例快速抗原诊断和免疫荧光法检测阴性的患者建议也作病毒分离。3.病毒抗原检测(快速诊断试剂检测)。快速抗原检测方法可采用免疫荧光的方法，检测呼吸道标本，使用单克隆抗体来区分甲、乙型流感，一般可在数小时以内获得结果。4.血清学诊断检测。流感病毒特异性IgM和IgG抗体水平。动态检测的IgG抗体水平恢复期比急性期有4倍或以上升高有回顾性诊断意义。实验室检测虽然准确度高，但是成本高昂，操作较为繁琐，检测不够及时，无法满足广大养殖户的禽流感监测需求。国内禽流感诊断试剂的产业化和商业化发展相对滞后，标准化的禽流感诊断试剂具有广阔的市场空间。人感染H5N1符合禽-人传播，可能存在环境-人传播。病毒抗原及基因检测可检测甲型流感病毒核蛋白抗原(NP)或基质蛋白(M1)、禽流感病毒H亚型抗原。还可用RT-PCR法检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。可从患者呼吸道标本中，特别是上呼吸道标本中分离出禽流感病毒。感染禽流感病毒后，除了对症治疗以外，需要尽早(在发病48小时内)口服奥司他韦，因此快速检测显得尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂可以通过口腔拭子定量检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的浓度，检测灵敏度高且快捷，可以实现实时检测，检测成本低。本专利技术的第二目的在于提供一种所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，所述制备方法工艺简单，重复性好，操作方便。本专利技术的第三目的在于提供一种所述的荧光试剂对口腔中流感病毒血凝素蛋白的检测方法，所述荧光试剂可用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的含量，以口腔拭子作为采样方法，在口腔中检测流感病毒，可以实现对流感的实时监测，检测方法简单，灵敏度高，检测成本低。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，包括化合物A、溶剂B和溶液C；所述化合物A的结构式如下：其中，X包括碘和溴中的任一种，R选自烷基中的任一种；所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。优选的，所述X为碘。所述R为甲基或乙基，优选为甲基。本专利技术采用化合物A制备得到的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有实时的荧光“点亮”效果，且检测快速；对于H5N1血凝素蛋白的检测，不受口腔中的成分的干扰，对H5N1血凝素蛋白具有特异性检测；并且，本专利技术所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测。口腔中的病毒含量通常可达105.2EID50/mL，换算后约为1μg/mL，因而本专利技术的化合物A制备得到的荧光试剂可对口腔中的流感病毒血凝素蛋白含量进行精确检测。上述检测限的计算方式是基于荧光滴定法计算检测限的。首先测试空白测量的标准偏差，采用纯溶液的发射强度重复测试10次，在血凝素蛋白质存在下，溶液的发射强度独立地重复测量三次，并且将强度的平均值与对应的浓度作图，用于确定直线斜率，使用以下公式计算检测限：检测限＝3δ/k其中，δ是纯化合物A的发射强度的标准偏差，k是发射强度与血凝素蛋白浓度之间的斜率。并且，本专利技术所述的荧光试剂的荧光稳定性好，检测灵敏度高，并且易于保存。本专利技术所述的荧光试剂能够用于检测流感病毒血凝素蛋白，通过对机理探究，发现，化合物A中小粒径的部分能够在特定位点之间的静电相互作用的驱动下进入血凝素蛋白中的孔隙，从而实现对血凝素蛋白的检测。优选的，所述荧光试剂中，化合物A的浓度为10-6mol/L-10-4mol/L，优选为10-6mol/L-9.0×10-5mol/L，进一步优选为10-6mol/L。优选的，所述溶剂B与所述溶液C的体积比为1﹕(99-9999)，进一步优选为1﹕9999。优选的，所述溶剂B为二甲基亚砜。所述水优选为去离子水。优选的，所述口腔拭子溶液的制备方法包括：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入采样液中，即得。更优选的，浸入3-4mL的采样液中。进一步优选的，所述采样液包括去离子水。优选的，所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液中H5N1血凝素蛋白的浓度为0-1.8μg/mL。本专利技术还提供了一种所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，包括如下步骤：将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。本专利技术所述的荧光试剂的制备方法工艺简单，重复性好，操作方便。本专利技术还提供了一种所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，包括如下步骤：(a)绘制标准工作曲线；(b)采集口腔拭子，浸入采样液，得到待测口腔拭子采样液；(c)测试荧光试剂荧光强度，向荧光试剂中加入1-30μL的待测口腔拭子采样液，测试荧光强度。口腔拭子取样方法是最简单、无痛、无创的采样方法。该方法适用于采集任何年龄段的人群样本，整个采样过程方便、迅速、隐私。特别是感染初期，口腔中的浓度最高。本检测方法使用口腔咽拭子，在口腔中检测流感病毒。人感染H5N1后发病的1～16天，都可从患者鼻咽部分离物中检出病毒。口腔中成分较复杂，含有多种蛋白质、糖类等物质，而本专利技术的荧光试剂可采用口腔拭子溶液作为分散的溶液，口腔中的各种成分不会影响荧光试剂中的化合物A对血凝素蛋白的响应。这主要也是因为化合物A结构中的N+和I-或者Br-对血凝素蛋白的特异性响应。本专利技术所述的荧光试剂不受口腔中其它成分的影响，对口腔中流感病毒血凝素蛋白具有特异性响应，并且能够对血凝素蛋白实现实时检测，实现快速检测，克服了现有技术中检测方法复杂以及周期长的问题。优选的，所述步骤(c)中，测试荧光强度后，对照标准工作曲线，得到口腔拭子中流感病毒血凝素蛋白的含量。优选的，所述采样液包括去离子水。优选的，所述步骤(b)中，用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3-4mL采样液中。优选的，所述标准工作曲线的绘制方法包括：测试荧光试剂的初始强度I0，向荧光试剂中逐步加入流感病毒血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，包括化合物A、溶剂B和溶液C；所述化合物A的结构式如下：

【技术特征摘要】
1.用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，包括化合物A、溶剂B和溶液C；所述化合物A的结构式如下：其中，X包括碘和溴中的任一种，R选自烷基中的任一种；所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。2.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述荧光试剂中，化合物A的浓度为10-6mol/L-10-4mol/L，优选为10-6mol/L-9.0×10-5mol/L，进一步优选为10-6mol/L。3.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述溶剂B与所述溶液C的体积比为1﹕(99-9999)，进一步优选为1﹕9999。4.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述口腔拭子溶液的制备方法包括：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入采样液中，即得；优选的，浸入3-4mL的采样液中；优选的，所述采样液包括去离子水。5.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液中H5N1血凝素蛋白的浓度为0-1.8μg/mL。6.权利要求1-5任一项所述的用于检测口...

【专利技术属性】
技术研发人员：董宇平，潘小玲，张亚会，佟斌，石建兵，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11