铅、镉混合暴露检测在无精子症辅助诊断中的应用制造技术

本发明专利技术属于分析化学及临床医学领域，公开了铅、镉混合暴露检测在无精子症辅助诊断中的应用。与无精子症相关的暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。采用ICP‑MS检测全血中的铅和镉的浓度，可用于无精子症的辅助诊断，用血量少、操作简单、快速、准确，具有较好的临床推广价值。

Application of mixed exposure detection of lead and cadmium in assistant diagnosis of azoospermia

The invention belongs to the field of analytical chemistry and clinical medicine, and discloses the application of mixed exposure detection of lead and cadmium in assistant diagnosis of azoospermia. The exposure biomarkers associated with azoospermia are mixed exposure of lead and cadmium. The detection of lead and cadmium in whole blood by ICP MS can be used for assistant diagnosis of azoospermia. It is simple, rapid and accurate, and has good clinical popularization value.

【技术实现步骤摘要】
铅、镉混合暴露检测在无精子症辅助诊断中的应用专利
本专利技术属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与无精子症相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为铅镉混合暴露，其检测方法为基于ICP-MS的检测方法。
技术介绍
全球范围内，遭受不孕不育的困扰的育龄夫妇占比约为8％～15％。目前我国不孕不育症的发生率已高达15％～20％，其中男性因素占30％。WHO不育症防治专题组的研究表明：生殖内分泌功能紊乱，特别是精液质量低下是男性不育的重要病因。在男性不育患者中，由于基因突变引起的无精子症占30％以上。精子生成是一个复杂的生理过程，其特点是细胞类型的有序增生和分化，即从二倍体的精原细胞到单倍体的精细胞，再经精细胞形成精子。在过去50年中，男性精液质量，尤其是精子生成数量有了相当程度的下降，我国的研究也呈现出相类似的情况。由于短期内遗传变异相对有限，因此我们有理由相信，无精子症更可能是受到了某些环境危险因素的影响。环境毒物由于患者认识不足和检测技术的限制，是较容易被临床所忽略的重要病因。铅(Pb)和镉(Cd)都是人们日常生活中接触较多的重金属。铅因其用途广泛，已成为人类接触最为密切的重金属之一。大量研究发现，铅对雄性生殖系统的毒性作用机理十分复杂。涉及精子发生过程、类同醇生成及氧化还原系统等。有实验发现，铅能引起睾丸的退行性变化，铅中毒的动物睾丸和附睾的平均重量减轻。同时，铅能直接损伤睾丸的生精系统，使之产生代谢障碍，造成精子生成数量减少，形态发生改变，由于铅使精子轴丝浓缩、变性，故能导致其活力降低。人群可通过工业污染、饮水、食物和吸烟等途径暴露于镉。雄性生殖系统是镉毒性重要靶点，其可通过引起睾丸细胞和生殖细胞发生氧化应激导致男性发生不育。雄性生殖系统对镉毒性高度敏感。镉暴露导致血清中促黄体生成素(LH)的分泌规律被打破，引起卵泡刺激素(FSH)的分泌水平下降，进一步导致睾酮水平出现明显下降，且其下降的水平与镉的暴露水平具有一定的相关性。镉暴露的条件下，发育成熟的精子会出现头部畸形(无头，双头，小头，巨头，香蕉头)、尾部畸形(无尾，双尾，尾折叠)和运动能力的下降。通常情况下，环境毒物均呈混合暴露的状态，而铅或镉的混合暴露被证明可以破坏睾丸性激素代谢，增加氧化应激水平并造成睾丸和附睾中的精子数量减少等。因此，铅、镉混合暴露可能是无精子症的重要病因，应当在临床上引起更多的关注和重视。不同化学物质间的相互作用一般可分为以下几种：协同作用、相加作用及拮抗作用。有研究发现，铅和镉的毒性具有协同效应，铅和镉的混合暴露比铅、镉的单独暴露的危害要大，但是，单独暴露均处于安全浓度的铅、镉，是否在混合暴露时能够导致无精子症尚有待进一步研究。常用的重金属分析方法主要有：紫外-可见分光光度法(UV)、原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)、X射线荧光光谱法(XRF)、电感耦合等离子体法光谱法(ICP-AES)、和电感耦合等离子质谱法(ICP‐MS)。目前为止最先进的分析方法是电感耦合等离子质谱法(ICP‐MS)，在美国、欧盟等国大量使用此方法进行重金属的检测，国内应用尚不广泛。在国内，特别是在无精子症辅助诊断领域，还未开发使用ICP-MS分析男性全血中铅、镉混合暴露水平的技术。如果能发现无精子症与铅、镉混合暴露作为辅助诊断标志物之间的关联，并开发出无精子症的ICP-MS辅助检测方法，不仅将具有很大的商业价值，对男性生殖健康水平也会有进一步的促进和提升。
技术实现思路
本专利技术的目的是：1.将铅、镉混合暴露作为无精子症辅助诊断标志物；2.建立基于ICP-MS的男性全血中铅、镉混合暴露的检测方法；3.开发用于无精子症辅助诊断的铅、镉混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。本专利技术的目的通过下列技术措施实现的：与无精子症相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。用于检测所述暴露生物标志物的方法，该方法为采用ICP-MS检测男性全血中铅和镉的浓度，特别是采用内标与标准曲线混合的ICP-MS检测男性全血中铅和镉的浓度。所述的检测方法，该检测方法的具体步骤及参数为：a.ICP-MS点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，Ba、Bi、Ce、Co、Ln、Li、U，每种浓度1μg/L，基质为2.5％HNO3、0.5％HCl)，根据Li、In和U的灵敏度，氧化物(CeO)以及双电荷(Ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7Li≥4000cps/ppb、115In≥15000cps/ppb；238U≥20000cps/ppb；标准模式双电荷Ba2+/Ba<3.0％；标准模式氧化物156CeO/140Ce<2.0％；优化的操作参数见表1.1；表1.1ICP-MS优化的操作参数b.仪器采集参数见表1.2，仪器在检测样本时在动能歧视(KineticEnergyDiscrimination，KED)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体；使用清洗液冲洗系统。表1.2ICP-MS采集参数其他步骤详见厂商说明书。所述的暴露生物标志物在制备检测无精子症的辅助诊断试剂盒中的应用。一种用于检测无精子症的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有采用ICP-MS检测男性全血中的铅和镉的浓度的试剂。所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：试剂A：稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10μg/L铑+10μg/L铋，其余为去离子水)；试剂B：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50μg/L；试剂C：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/L；试剂D：清洗液：2％v/v硝酸。(注：标准曲线采用稀释剂配置，标准曲线0浓度就是稀释剂。内标元素含量通过该元素的标准液稀释而来。)本专利技术详细描述如下：本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的男性全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于ICP-MS检测方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据纳入病例男性120人，根据年龄、BMI、禁欲时间匹配对照120人，共240人。A组：健康对照组(120人，精液检查和生育力正常)：1.年龄在22到37岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。B组：病例组(120人，精液检查无精子)：1.年龄在25到38岁间；2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；3.无吸烟、饮酒史；4.无泌尿生殖道炎症、附睾炎、睾丸损伤、隐睾等疾病史；5.无性功能异常或排精异常；6.无其他与男性生殖障碍有关的疾病史。二、ICP-MS检测铅、镉混合暴露与无精子症发生的分析1.样本前处理取100μl全血，加入4.9ml试剂A(即稀释50倍)，充分混匀。2.仪器检测分析仪器：ICAPRQICP-MS(Thermo)a.ICP-MS点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液(由仪器厂家配套提供，Ba、Bi、Ce、Co、Ln、Li、U，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与无精子症相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。

【技术特征摘要】
1.与无精子症相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为铅和镉的混合暴露。2.用于检测权利要求1所述暴露生物标志物的方法，其特征在于该方法为采用ICP-MS检测男性全血中铅和镉的浓度。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于该方法为采用内标与标准曲线混合的ICP-MS检测男性全血中铅和镉的浓度。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于该检测方法的具体步骤及参数为：a.ICP-MS点火启动后，稳定约半小时；泵入1ppb调谐液，根据Li、In和U的灵敏度，氧化物(CeO)以及双电荷(Ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态；调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7Li≥4000cps/ppb、115In≥15000cps/ppb；238U≥20000cps/ppb；标准模式双电荷Ba2+/Ba<3.0％；标准模式氧化物156CeO/140Ce<2.0％；优化的操...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏彦恺，张明智，卢婷，徐俏俏，董天宇，陈敏健，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32