磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于电化学生物传感器技术领域，公开了磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器及其制备与应用。所述生物传感器由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及全氟磺酸树脂溶液混合，负载在工作电极表面成膜制备而成。本发明专利技术还公开了传感器的制备方法。本发明专利技术的制备方法简单且成本低；获得的传感器具有良好的选择性、灵敏度和稳定性，酶的固定量和稳定性好，具有较好的电催化性能；对过氧化氢进行准确检测，抗干扰能力强；同时具有较宽的检测范围，较低的检测限。

Hydrogen peroxide biosensor based on sulfonated carbon nanotubes and horseradish peroxidase and its preparation and Application

The invention belongs to the technical field of electrochemical biosensor, and discloses a sulfonated carbon nanotubes composite horseradish peroxidase hydrogen peroxide biosensor and its preparation and application. The biosensor is composed of a reference electrode, a pair of electrodes and a modified working electrode. The modified working electrode is composed of a working electrode and a material recognition film solidified on the surface of the working electrode. The material recognition film is mainly composed of a sulfonated carbon nanotube dispersion solution, a horseradish peroxidase solution and a perfluorosulfonic acid resin solution, and is loaded on the surface of the working electrode. The membrane is prepared. The invention also discloses a preparation method of the sensor. The preparation method of the present invention is simple and low cost; the obtained sensor has good selectivity, sensitivity and stability, good enzyme immobilization and stability, and good electrocatalytic performance; accurate detection of hydrogen peroxide has strong anti-interference ability; at the same time, it has wide detection range and low detection limit.

【技术实现步骤摘要】
磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器及其制备与应用
本专利技术属于电化学生物传感器
，具体涉及一种基于磺化碳纳米管的检测过氧化氢的酶生物传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
过氧化氢是生物体中许多生物化学反应的中间体或产物。广泛应用于食品工业，主要用于消毒、杀菌、消毒、面包发酵等，并且还可用作食品添加剂中的加工助剂。国标中规定，加工助剂一般应在食品中除去而不应成为最终食品的成分，或仅有残留。在加工食品过程中，过氧化氢残留量的检测应严格把控。目前，检测过氧化氢的方法有：传统的检测过氧化氢的方法：滴定法、化学发光法、色谱等。滴定法检测过氧化氢应用广泛，但试剂中常含少量杂质，溶液不稳定；化学发光法检测过氧化氢很容易出现PBS缓冲溶液空白值很高的现象，实验结果很难得到；高效液相色谱法易操作，准确度高，但其选择性较低，相对比而言，电化学传感器具有对目标物有较高的识别能力，样品用量少、响应快，成本低、体积小，便于普及的优点，因此，研发简便、快速、精准、灵敏度高的电化学过氧化氢酶生物传感器将在临床医学上有重大应用前景。在电化学酶生物传感器的制备过程中，一个非常重要的问题就是酶修饰电极的稳定性和寿命，酶催化剂的固定对传感器的稳定性和寿命有重要的影响。虽然纳米材料会在一定程度上改善酶电极的性能，但是其改善的程度有限。如：碳纳米管是具有一类特殊结构的纳米材料，具有粒径小，比表面积大，表面活性高，催化效率高等优点，由于其特殊的物理化学性质，它在电化学领域被广泛用于酶修饰电极的修饰材料。但是，碳纳米管亲水性不好，在水溶液中分散性不好，限制了其应用。对于电化学酶生物传感器，还存在另一个要解决的重要问题，酶作为催化剂，其活性中心的外面包裹着一层蛋白质外壳，这层蛋白质外壳阻碍了酶活性中心催化反应产生的电子向电极表面的传递，从而影响了催化电流在检测仪器上的反映，因此，酶修饰电极制备过程中要解决电子从酶活性中心向电极表面的传递问题。在传统电化学过氧化氢酶生物传感器中，采用电子介体可以加速电子从酶活性中心到电极表面转移。但电子媒介体的存在不利于过氧化氢传感器的构建，也不利于待测体系的无污染检测。因此，不需要电子介体的酶生物传感器的制备就具有很大的研究价值。
技术实现思路
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器。本专利技术的另一目的在于提供上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述基于磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在过氧化氢检测中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液(SCNT)、辣根过氧化物酶溶液(HRP)及全氟磺酸树脂溶液(Nafion)混合，负载在工作电极表面成膜制备而成；所述全氟磺酸树脂溶液为通过调节pH为中性的全氟磺酸树脂溶液；所述磺化碳纳米管分散液(SCNT)是将磺化碳纳米管分散于全氟磺酸树脂溶液(酸性溶液)中得到；所述辣根过氧化物酶溶液(HRP)是采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液得到。所述磺化碳纳米管：辣根过氧化物酶的质量比为(2.5～15)：(5～50)。所述磺化碳纳米管是将碳纳米管进行酸化，获得酸化碳纳米管；然后采用对氨基苯磺酸重氮盐进行磺化处理得到。所述对氨基苯磺酸重氮盐与酸化碳纳米管的摩尔质量比为(0.5～2.9)mmol：100mg；所述磺化处理的条件为冰浴条件下搅拌反应1～5h。上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)对基底电极进行表面预处理；(2)将磺化碳纳米管分散于全氟磺酸树脂溶液(酸性溶液)中，得到磺化碳纳米管分散液；采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液，得到辣根过氧化物酶溶液(HRP)；调节全氟磺酸树脂溶液的pH至中性，获得中性全氟磺酸树脂溶液；(3)将磺化碳纳米管材料分散液、辣根过氧化物酶溶液及中性全氟磺酸树脂溶液混合均匀得复合溶液；(4)将复合溶液滴加到步骤(1)的电极表面，室温晾干，得到基于磺化碳纳米管的酶修饰工作电极；(5)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测过氧化氢的生物传感器。所述磺化碳纳米管的具体制备步骤：(a)将碳纳米管进行酸化处理，获得酸化碳纳米管；(b)然后采用对氨基苯磺酸重氮盐对酸化处理的碳纳米管进行磺化处理，获得磺化碳纳米管。步骤(a)中所述酸化处理是指采用浓硝酸与浓硫酸的混合酸进行处理。步骤(b)中所述磺化处理：(b-1)将酸化碳纳米管分散于水中，获得酸化碳纳米管分散液；(b-2)将对氨基苯磺酸重氮盐与酸化碳纳米管分散液混合，冰浴1-5小时，再在室温下冷却1-3小时，然后超声15-20分钟，洗涤，干燥，获得磺化碳纳米管。步骤a)中对氨基苯磺酸重氮盐是通过以下方法得到：184mg对氨基苯磺酸、72mg亚硝酸钠、30-100mL水和1-6g1mol/L盐酸或硫酸在冰浴条件下进行反应，获得含有对氨基苯磺酸重氮盐的溶液。步骤(1)中所述表面预处理具体是指：将基底电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，晾干。步骤(2)中所述磺化碳纳米管材料分散液的浓度为2.5～15mg/mL，分散剂为全氟磺酸树脂溶液(Nafion溶液，酸性溶液)，其质量浓度0.5-1％。所述全氟磺酸树脂溶液为5％杜邦Nafion溶液用乙醇稀释至0.5-1.0％制得。步骤(2)中所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为5～50mg/mL，酶溶液是采用PBS溶液配制的(pH7.0，0.1M)。步骤(2)中所述中性全氟磺酸树脂溶液为由强碱溶液调节全氟磺酸树脂溶液的pH为中性制得；所述全氟磺酸树脂溶液为5％杜邦Nafion溶液用乙醇稀释至0.5-1.0％制得；所述强碱为0.1mol/L氢氧化钠。步骤(3)中所述磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及中性全氟磺酸树脂溶液的体积比为1:1:1。步骤(4)中所述复合溶液滴加量为3～10μL。上述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器在过氧化氢定量检测中的应用。本专利技术将碳纳米管经过酸处理增加了酶的吸附性和稳定性；而将酸化的碳纳米管进行磺化处理，把磺酸基团引入碳纳米管中有利于增加其结构的有序性和导电性，提高其亲水性，有效的提高酶催化剂的载量，从而提高酶修饰电极的性能，也可以增加酶修饰电极的稳定性，使过氧化氢酶生物传感器表现出更优异的性能。本专利技术的原理：本专利技术首先是制备磺化碳纳米管材料，该材料先通过酸处理引入羧基来增加酶的吸附性和稳定性，随后进行磺化处理引入磺酸基团，进而增加其结构的有序性和导电性。然后，利用全氟磺酸树脂的成膜性，有力增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，以利于对底物的催化；最后，取适量混合液滴于已表面预处理的工作电极上，得到修饰后的工作电极；再利用修饰后的工作电极，配合参比电极与对电极组成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器，其特征在于：由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及全氟磺酸树脂溶液混合，负载在工作电极表面成膜制备而成；所述全氟磺酸树脂溶液为通过调节pH为中性的全氟磺酸树脂溶液；所述磺化碳纳米管分散液是将磺化碳纳米管分散于酸性的全氟磺酸树脂溶液中得到；所述辣根过氧化物酶溶液是采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液得到；所述磺化碳纳米管：辣根过氧化物酶的质量比为(2.5～15)：(5～50)；所述磺化碳纳米管是将碳纳米管进行酸化，获得酸化碳纳米管；然后采用对氨基苯磺酸重氮盐进行磺化处理得到。

【技术特征摘要】
1.一种磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器，其特征在于：由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由磺化碳纳米管分散液、辣根过氧化物酶溶液及全氟磺酸树脂溶液混合，负载在工作电极表面成膜制备而成；所述全氟磺酸树脂溶液为通过调节pH为中性的全氟磺酸树脂溶液；所述磺化碳纳米管分散液是将磺化碳纳米管分散于酸性的全氟磺酸树脂溶液中得到；所述辣根过氧化物酶溶液是采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液得到；所述磺化碳纳米管：辣根过氧化物酶的质量比为(2.5～15)：(5～50)；所述磺化碳纳米管是将碳纳米管进行酸化，获得酸化碳纳米管；然后采用对氨基苯磺酸重氮盐进行磺化处理得到。2.根据权利要求1所述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器，其特征在于：所述对氨基苯磺酸重氮盐与酸化碳纳米管的摩尔质量比为(0.5～2.9)mmol：100mg；所述磺化处理的条件为冰浴条件下搅拌反应1～5h。3.根据权利要求1～2任一项所述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)对基底电极进行表面预处理；(2)将磺化碳纳米管分散于全氟磺酸树脂溶液中，得到磺化碳纳米管分散液；采用PBS溶液将辣根过氧化物酶配成溶液，得到辣根过氧化物酶溶液；调节全氟磺酸树脂溶液的pH至中性，获得中性全氟磺酸树脂溶液；(3)将磺化碳纳米管材料分散液、辣根过氧化物酶溶液及中性全氟磺酸树脂溶液混合均匀得复合溶液；(4)将复合溶液滴加到步骤(1)的电极表面，室温晾干，得到基于磺化碳纳米管的酶修饰工作电极；(5)将修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测过氧化氢的生物传感器。4.根据权利要求3所述磺化碳纳米管复合辣根过氧化物酶的过氧化氢生物传感器的制备方法，其特征在于：所述磺化碳纳米管的具体制备步骤：(a)将碳纳米管进行酸化处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴金花，肖焱堃，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44