一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法技术

本发明专利技术公开了一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括：于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20‑28℃暗培养；取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒后催芽；将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；用1/2强度的霍格兰营养液浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直放入花盆的河沙中；白三叶草生长1个月后检查AMF侵染情况；将成功侵染的白三叶草移栽回花盆，继续培养4个月后收获。本发明专利技术单孢扩繁成功率高，耗时短。

An Efficient Monospore Propagation Method for Arbuscular Mycorrhizal Fungi

The invention discloses an efficient monospore propagation method of arbuscular mycorrhizal fungi, which includes: placing uniform microporous filter membrane discs on quartz sand in Petri dish, transferring AMF spores to the surface of microporous filter membrane with a pipette gun, transferring a fresh collected spore with full appearance with each microporous filter membrane, covering the dish, dark culture at 20 28 C, extracting clover seeds, and urging after disinfection with concentrated sulfuric acid surface. Bud: Transfer germinated spores together with microporous filter membrane discs into folded wet filter paper, and transfer a seedling of white clover which has just grown true leaves; soak the river sand in flowerpot with 1/2 intensity Hoagland nutrient solution, and put the filter paper carrying spores and white clover vertically into the river sand of flowerpot; check AMF infection after one month of growth of white clover; White clover was transplanted back to the pot and harvested after 4 months of continuous cultivation. The invention has high success rate of monospore propagation and short time-consuming.

【技术实现步骤摘要】
一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法
本专利技术属于生物
，具体来说涉及一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法。
技术介绍
丛枝菌根真菌（AMF）是一类不能纯培养的植物共生菌，在对AMF共生机制及生理生化的研究中往往需要获得较为纯净的AMF材料，单孢扩繁是从野外环境获取AMF纯净材料的重要方法。目前单孢扩繁主要采用指形管法，即在指形管中对三叶草接种单个孢子，一般4个月后检查结果并进一步扩繁。由于AMF繁殖周期较长，加上野外采集的AMF孢子活力较低，同时在使用指形管的扩繁过程中无法检测是否成功侵染，使得这种方法耗时较长且成功率很低。Brundrett等在1996年《菌根在林业和农业中的应用》p158-159中提出了一种AMF的单孢扩繁方法：首先进行AMF孢子萌发实验，随后选取萌发的孢子接种三叶草。该方法在一定程度上弥补了以上指形管法的缺陷，但由于孢子转移过程可能对孢子产生损伤，另外根系在基质中的生长方向不确定，很难保证萌发的菌丝能够侵染根系，因而这种方法的成功率也很低。目前为止，受限于野外采集的孢子活力较低和根系及菌丝生长的随机性，常规单孢扩繁方法需要6-8个月的周期且成功率不到10%。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺点而提供的一种单孢扩繁成功率高，耗时短的丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法。本专利技术目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：本专利技术的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）在灭菌培养皿中加入灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂，于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20-28℃暗培养；（2）取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒5-10min无菌水冲洗后20-28℃催芽；（3）准备河沙，于烘箱内灭菌，将灭菌的河沙装入花盆中待用；（4）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况，将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；（5）用1/2强度的霍格兰营养液浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直放入花盆的河沙中；（6）白三叶草生长1个月后，将滤纸取出，展开滤纸，于解剖镜下检查AMF侵染情况；（7）将成功侵染的白三叶草移栽回花盆，继续培养4个月后收获。上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：微孔滤膜圆片为微孔滤膜用打孔器制取。上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：滤纸、玻璃培养皿、蒸馏水和石英砂与微孔滤膜圆片一起高压蒸汽灭菌。上述的的一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，其中：折叠的浸湿滤纸是将滤纸对折两次后用灭菌蒸馏水浸湿。本专利技术同现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，本专利技术的通过筛选萌发的孢子并在滤纸夹层中接种白三叶草，提高了菌丝侵染白三叶草根系的概率和扩繁的成功率，缩短了单孢扩繁所需时间。由于进行了孢子萌发率筛查和侵染筛查，该方法最终扩繁成功率可达到80%，扩繁时间仅需5个月，较传统方法节省1-3个月的时间。具体实施方式实施例1一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）取孔径为0.22μm的微孔滤膜，用直径5mm的打孔器制取微孔滤膜圆片。另取直径11cm的滤纸、直径9cm的玻璃培养皿、蒸馏水和石英砂与微孔滤膜圆片一起高压蒸汽灭菌。将直径11cm的滤纸对折两次后用灭菌蒸馏水浸湿备用；（2）在灭菌培养皿中加入5mm厚的灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂。于培养皿内石英砂上均匀摆放20片微孔滤膜圆片。用100μl移液枪转移从温带地区分离的AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子。盖好皿盖，25℃暗培养5天；（3）取白三叶草种子，用浓硫酸表面消毒10min无菌水冲洗后置于0.6%水琼脂培养基上25℃催芽，前3天暗培养，后续见光培养；（4）准备过2mm筛的河沙，于烘箱内180℃灭菌2小时。将灭菌的河沙装入1.5L花盆中待用；（5）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况。将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的滤纸内，一张滤纸转移一个萌发的孢子，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗，使三叶草根系与萌发的孢子接触。轻压滤纸使其贴合成平面；（6）用1/2强度的霍格兰营养液（磷浓度为20μmol/L）浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直插入花盆的河沙中。每隔3天，浇水一次，每次50ml；每隔7天，浇一次1/2强度的霍格兰营养液（磷浓度为20μmol/L），每次50ml；（7）白三叶草生长1个月后，将滤纸取出。展开滤纸，于解剖镜下检查AMF侵染情况；（8）将成功侵染的白三叶草弃去滤纸后移栽回原花盆，继续培养4个月后收获。本方法扩繁成功率可达到80%，扩繁时间5个月。实施例2一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）取孔径为0.22μm的微孔滤膜，用直径5mm的打孔器制取微孔滤膜圆片。另取直径11cm的滤纸、直径9cm的玻璃培养皿、蒸馏水和石英砂与微孔滤膜圆片一起高压蒸汽灭菌。将直径11cm的滤纸对折两次后用灭菌蒸馏水浸湿备用；（2）在灭菌培养皿中加入5mm厚的灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂。于培养皿内石英砂上均匀摆放20片微孔滤膜圆片。用100μl移液枪转移从寒带或寒温带地区分离的AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子。盖好皿盖，20℃暗培养5天；（3）取白三叶草种子，用浓硫酸表面消毒5min无菌水冲洗后置于0.6%水琼脂培养基上20℃催芽，前3天暗培养，后续见光培养；（4）准备过2mm筛的河沙，于烘箱内180℃灭菌2小时。将灭菌的河沙装入1.5L花盆中待用；（5）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况。将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的滤纸内，一张滤纸转移一个萌发的孢子，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗，使三叶草根系与萌发的孢子接触。轻压滤纸使其贴合成平面；（6）用1/2强度的霍格兰营养液（磷浓度为20μmol/L）浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直插入花盆的河沙中。每隔3天，浇水一次，每次50ml；每隔7天，浇一次1/2强度的霍格兰营养液（磷浓度为20μmol/L），每次50ml；（7）白三叶草生长1个月后，将滤纸取出。展开滤纸，于解剖镜下检查AMF侵染情况；（8）将成功侵染的白三叶草弃去滤纸后移栽回原花盆，继续培养4个月后收获。本方法扩繁成功率可达到80%，扩繁时间5个月。实施例3一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）取孔径为0.22μm的微孔滤膜，用直径5mm的打孔器制取微孔滤膜圆片。另取直径11cm的滤纸、直径9cm的玻璃培养皿、蒸馏水和石英砂与微孔滤膜圆片一起高压蒸汽灭菌。将直径11cm的滤纸对折两次后用灭菌蒸馏水浸湿备用；（2）在灭菌培养皿中加入5mm厚的灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂。于培养皿内石英砂上均匀摆放20片微孔滤膜圆片。用100μl移液枪转移从热带地区分离的AMF孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子。盖好皿盖，28℃暗培养5天；（3）取白三叶草种子，用浓硫酸表面消毒10min无菌水冲洗后置于0.6%水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）在灭菌培养皿中加入灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂，于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移丛枝菌根真菌（AMF）孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20‑28 ℃暗培养；（2）取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒5‑10min无菌水冲洗后20‑28℃催芽；（3）准备河沙，于烘箱内灭菌，将灭菌的河沙装入花盆中待用；（4）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况，将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；（5）用1/2强度的霍格兰营养液浸润花盆中的河沙，将携带孢子和白三叶草的滤纸片垂直放入花盆的河沙中；（6）白三叶草生长1个月后，将滤纸取出，展开滤纸，于解剖镜下检查AMF侵染情况；（7）将成功侵染的白三叶草移栽回花盆，继续培养4个月后收获。

【技术特征摘要】
1.一种丛枝菌根真菌的高效单孢扩繁方法，包括以下步骤：（1）在灭菌培养皿中加入灭菌石英砂，用蒸馏水浸润石英砂，于培养皿内石英砂上均匀摆放微孔滤膜圆片，用移液枪转移丛枝菌根真菌（AMF）孢子至微孔滤膜表面，每片微孔滤膜转移1个外观饱满的新鲜收集的孢子，盖好皿盖，20-28℃暗培养；（2）取白三叶草种子，浓硫酸表面消毒5-10min无菌水冲洗后20-28℃催芽；（3）准备河沙，于烘箱内灭菌，将灭菌的河沙装入花盆中待用；（4）打开皿盖，于解剖镜下检查孢子萌发情况，将萌发的孢子连同微孔滤膜圆片一起转移至折叠的浸湿滤纸内，同时转接一颗刚长出真叶的白三叶草幼苗；（5）用1/2强度...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙学广，石静，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52