测定25-羟基维生素D的方法技术

技术编号:20094225 阅读:82 留言:0更新日期:2019-01-15 12:53
本申请公开了一种检测25‑羟基维生素D的方法,所述方法包括:用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育,其中所述第一试剂包括在酸性缓冲溶液中的第一磁微粒和第二磁微粒,其中所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素磁微粒,所述第二磁微粒是与所述第一磁微粒不同的磁微粒;所述第二试剂包括25‑羟基维生素D抗体标记物;进一步加入包括生物素化的25‑羟基维生素D的第三试剂共孵育;分离磁微粒;和加入发光底物并检测发光强度。本发明专利技术的方法同时适用于在血清和血浆样品中检测25‑羟基维生素D,而不需额外的样本处理试剂,也不需额外的处理样品的步骤。

Method for determination of 25-hydroxyvitamin D

The present application discloses a method for detecting 25_hydroxyvitamin D. The method includes: incubation of biological samples with first reagent and second reagent. The first reagent includes first and second magnetic particles in acid buffer solution. The first magnetic particle is a magnetic particle coated with chain enzyme affinity, and the second magnetic particle is a magnetic particle coated with the first magnetic particle. Different magnetic particles; the second reagent includes 25 hydroxyvitamin D antibody markers; further co-incubation with a third reagent including biotinylated 25 hydroxyvitamin D; separation of magnetic particles; and addition of luminescent substrates and detection of luminescent intensity. The method of the present invention is applicable to the detection of 25 hydroxyvitamin D in serum and plasma samples without additional sample processing reagents or additional sample processing steps.

【技术实现步骤摘要】
测定25-羟基维生素D的方法
本专利技术涉及血液样本中25-羟基维生素D的检测方法。
技术介绍
维生素D是一类脂溶性维生素,属于固醇类衍生物。维生素D主要功能是调节体内钙、磷代谢和维持血浆钙、磷水平的温度,并参与骨骼发育。维生素D家族主要包括维生素D1~D5,其中最重要的是维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。25-羟基维生素D是维生素D在肝脏中经干细胞微粒体的单氧酶系统的作用而形成的,是维生素D在体内的主要储存形式。血液中25-羟基维生素D的浓度能够反映人体内维生素D水平,是检测个体维生素D水平的最佳生化指标。25-羟基维生素D的传统检测方法有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法和化学发光法等。其中化学发光法能够利用自动化设备进行检测,操作相对简便。中国专利申请CN106199016A提出来一种磁微粒化学发光免疫检测方法来检测血清中25-羟基维生素D。该方法用25-羟基维生素D单克隆抗体包被的羧基化磁微粒与样品中的25-羟基维生素D进行特异性结合,并且进一步加入维生素D衍生物标记的吖啶酯化学发光标记物进行竞争结合,最后通过测定发光强度来定量检测25-羟基维生素D的含量。该方法通过事先用标准25-羟基维生素D的样品测画出标准曲线,从而能够利用全自动化学发光免疫分析系统进行检测,具有较高的检测灵敏度和准确性。但是,血液中的25-羟基维生素D与维生素D结合蛋白具有高度亲和力,要检测人血中的总25-羟基维生素D浓度,需要将其从结合蛋白上解离下来,常用的解离剂一般为pH酸性。血浆样本比血清样本蛋白含量高,在pH酸性环境下会等电析出大量蛋白物质,特别是血浆纤维蛋白,这些析出的蛋白物质会附着到磁微粒的表面,对采用磁微粒的检测方法造成干扰,造成血清和血浆测定结果差异较大。因此,目前采用磁微粒检测25-羟基维生素D的方法大多仅能检测血清样品,而不能用于检测血浆样品。雅培(Abbott)的25-羟基维生素D测定试剂盒也是利用磁微粒-化学发光法来测定25-羟基维生素D的试剂盒。样品量只有10μL,且采用两种不同的预处理液对样品进行混合孵育,再从中取出一部分进行检测。该方法对样品进行预处理液处理和稀释后,干扰物浓度大大下降,从而基本消除了血浆样品干扰物对测定结果的影响,是目前能够同时用于血清和血浆样品来检测25-羟基维生素D的试剂盒。然而,该方法需要对样品进行预处理,不仅增加了检测步骤,而且延长了检测时间。另外因加入两种预处理液,造成样品的稀释,检测样品量小,造成该试剂盒灵敏度不高,线性受到影响等缺陷。此外,尽管经过了预先处理,但是最终的检测结果在血清和血浆之间仍存在一定的差异。因此,能够同时用于血清和血浆样品来检测25-羟基维生素D的方法仍存在改进的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述技术问题中的至少一种。为此,本专利技术的目的是提供一种能够利用常规的全自动化学发光免疫分析仪对血清和血浆样品中的任意一种检测其中25-羟基维生素D的方法,所获得的检测结果基本不因样品是血清还是血浆而有显著的差异。具体地,本专利技术提供一种检测25-羟基维生素D的方法,所述方法包括:用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育,其中所述第一试剂包括在酸性缓冲溶液中的第一磁微粒和第二磁微粒,其中所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素磁微粒,所述第二磁微粒是与所述第一磁微粒不同的磁微粒;所述第二试剂包括25-羟基维生素D抗体标记物;进一步加入包括生物素化的25-羟基维生素D的第三试剂共孵育;和分离第一和第二磁微粒;加入发光底物并检测发光强度。所述包被有链酶亲和素的磁微粒没有特别限制,可以是市售的那些磁微粒,例如JSRlifesciences公司的MS300/Streptavidin磁微粒,但不限于此。第一磁微粒在第一试剂中的浓度可根据不同产品而不同,常规地可为0.1-1mg/mL,优选为0.1-0.4mg/mL,最优选为0.2mg/mL。所述第二磁微粒可为表面被-COOH、-Tosyl、-NH2或-OH改性的磁微粒。优选表面被羧基改性的磁微粒。所述第二磁微粒在第一试剂中的浓度为0.4-1mg/mL,优选为0.4-0.8mg/mL,最优选为0.6mg/mL。所述第一试剂中,所述第二磁微粒与第一磁微粒的质量比为2:1-8:1,考虑成本因素优选为2:1-4:1,最优选为3:1。所述第一和第二磁微粒的粒径通常在1.0-3.0μm的范围内,二者可以相同,也可以不同。特别是上述范围内的第二磁微粒的粒径,对检测准确性没有显著影响。所述第一试剂中的酸性缓冲溶液可为pH值为3.00-6.00的任何适宜缓冲液。具体实例有:0.2M的醋酸-醋酸钠缓冲液(~pH4.5),但不限于此。根据优选的实施方式,第一试剂可由pH为3.00-6.00的缓冲液、0.1-0.4mg/mL的所述第一磁微粒、0.4-0.8mg/mL的所述第二磁微粒组成。根据更优选的实施方式,第一试剂可由pH为4.5的0.2M的醋酸-醋酸钠缓冲液、粒径为1.5μm的0.2mg/mL的包被有链酶亲和素的所述第一磁微粒和粒径为1.5μm的0.6mg/mL的表面修饰有羧酸的所述第二磁微粒组成。所述第二试剂中的25-羟基维生素D抗体标记物是能够用于定量检测25-羟基维生素D的物质,其中所述标记物可选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、三联吡啶钌中的任意一种,最优选为辣根过氧化物酶。所述25-羟基维生素D抗体标记物的在第二试剂中的浓度为50-200ng/mL,优选80-130ng/mL,最优选为100ng/mL。所述第二试剂可常规地含有必要的添加剂,包括缓冲剂、氯化钠、蔗糖、表面活性剂、防腐剂等,但不限于此。这些添加剂可根据常规需求添加,而无特别限制。本专利技术中的第二试剂为常规进行检测用的含25-羟基维生素D抗体标记物的试剂,并无特别限制。根据一种示例性的实施方式,所述第二试剂由0.1mol/L的Tris-Hcl缓冲液、8.5g/L的氯化钠、20g/L的蔗糖、20g/L的聚乙二醇20000、1mL/L的Procline950、0.5mL/L的吐温-20、100ng/mL的辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素D抗体组成。用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育在约37℃下进行10-30分钟。所述生物样本可为血清或血浆样本。在具体实施方式中,所述生物样本取自哺乳动物,尤其取自人。第三试剂中的所述生物素化的25-羟基维生素D可以是任何市售的产品,例如菲鹏生物股份有限公司的货号:VD-BIO,但不限于此。在第三试剂中,所述生物素化的25-羟基维生素D的浓度通常可为0.5-2ng/mL,优选为1ng/mL。同样的第三试剂可常规地含有添加剂,例如:缓冲剂、氯化钠、蔗糖、表面活性剂、防腐剂等,但不限于此。这些添加剂可根据常规需求添加,而无特别限制。本专利技术的第三试剂也是常规试剂,并无特别限制根据一个示例性的实施方式,第三试剂由0.1mol/L的Tris-Hcl缓冲液、8.5g/L的氯化钠、20g/L的蔗糖、1mL/L的Procline950、0.5mL/L的吐温-20、1ng/mL的生物素化的25-羟基维生素D组成。用所述生物素化的25-羟基维生素D共孵育在约37℃下进行10-30分钟,优选进行20分钟。根据一种优选的实施方式,本专利技术的本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种检测25‑羟基维生素D的方法,所述方法包括:用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育,其中,所述第一试剂包括在酸性缓冲溶液中的第一磁微粒和第二磁微粒,其中,所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素磁微粒,所述第二磁微粒是与所述第一磁微粒不同的磁微粒,且所述第二试剂包括25‑羟基维生素D抗体标记物;进一步加入包括生物素化的25‑羟基维生素D的第三试剂共孵育;分离第一和第二磁微粒;和加入发光底物并检测发光强度。

【技术特征摘要】
1.一种检测25-羟基维生素D的方法,所述方法包括:用第一试剂和第二试剂与生物样本共孵育,其中,所述第一试剂包括在酸性缓冲溶液中的第一磁微粒和第二磁微粒,其中,所述第一磁微粒是包被有链酶亲和素磁微粒,所述第二磁微粒是与所述第一磁微粒不同的磁微粒,且所述第二试剂包括25-羟基维生素D抗体标记物;进一步加入包括生物素化的25-羟基维生素D的第三试剂共孵育;分离第一和第二磁微粒;和加入发光底物并检测发光强度。2.根据权利要求1所述的方法,其中,在第一试剂中,所述第一磁微粒的浓度为0.1-1mg/mL,优选为0.1-0.4mg/mL,最优选为0.2mg/mL。3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第二磁微粒为表面被-COOH、-Tosyl、-NH2或-OH改性的磁微粒。4.根据权利要求1所述的方法,其中,在第一试剂中,所述第二磁微粒浓度为0.4-1mg/mL,优选为0.4-0.8mg/mL,最优选为0.6mg/mL。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其中,所述第一试剂中,所述第二磁微粒与第一磁微粒的质量比为2:1-8:1,优选为2:1-4:1,最优选为3:1。6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一试剂中的酸性缓冲溶液的pH值为3.00-6.00。7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一试剂由pH为3.00-6.00的缓冲液、0.1-0.4mg/mL的所述第一磁微粒、0.4-0.8mg/mL的所述第二磁微粒组成;优选地,所述第一试剂由pH为4.5的0.2M的醋酸-醋酸钠缓冲液、粒径为1.5μm的0.2mg/mL的包被有链酶亲和素的所述第一磁微粒和粒径为1.5μm的0.6mg/mL的表面修饰有羧酸的所述第二磁微粒组成。8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第二试剂中的25-羟基维生素D抗体标记物为选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯和三联吡啶钌中的一种;优选地,所述25-羟基维生素D抗体标记物的在第二试剂中的浓度为50-200ng/mL,优选80-1...

【专利技术属性】
技术研发人员:李洪伟吴国平田君喜
申请(专利权)人:迈克生物股份有限公司
类型:发明
国别省市:四川,51

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