本发明专利技术属于蛋白质技术领域，主要涉及血清中一组特定糖型糖蛋白的检测方法，该方法是基于抗体‑凝集素夹心法检测原理，检测血清中一组具有多天线糖链结构的特定蛋白水平，包括但不限于转铁蛋白、α1酸性糖蛋白、胎球蛋白A、甲胎蛋白、α2‑巨球蛋白等。同时检测相应特定蛋白总量，计算多天线糖链结构特定蛋白与总特定蛋白的比值。本发明专利技术提供了相应的检测系统，并将该检测方法与检测系统用于原发性肝细胞癌(HCC)的辅助诊断及分层管理，特别是与HBV感染相关的HCC的辅助诊断及分层管理。
A Method for Detecting Specific Proteins with Multi-antenna Sugar Chain Structure in Serum and Its Application
The invention belongs to the field of protein technology and mainly relates to the detection method of a group of specific glycoproteins in serum. The method is based on the detection principle of antibody-agglutinin sandwich method to detect a group of specific proteins with multi-antenna sugar chain structure in serum, including but not limited to transferrin, alpha-1 acid glycoprotein, fetoprotein A, alpha-fetoprotein, alpha-2 macroglobulin, etc. At the same time, the total specific proteins were detected and the ratio of specific proteins with multi-antenna sugar chain structure to total specific proteins was calculated. The invention provides a corresponding detection system, and applies the detection method and detection system to the auxiliary diagnosis and hierarchical management of primary hepatocellular carcinoma (HCC), especially the auxiliary diagnosis and hierarchical management of HCC related to HBV infection.
【技术实现步骤摘要】
一种血清多天线糖链结构特定蛋白检测方法及其应用
本专利技术属于蛋白质
，涉及特定糖型糖蛋白的检测，具体涉及血清中一组多天线糖链结构的特定蛋白水平的检测及其临床应用。
技术介绍
血清糖蛋白的变化可以反映人体的生理、病理改变。近年来人们逐渐清楚地认识到蛋白糖基化修饰在很多疾病的发生发展中扮演着重要角色。糖蛋白分子由多肽链和糖链两部分组成，糖链结构在细胞识别、细胞间信号传递、细胞迁移、增殖及分化中均具有重要作用，因此糖蛋白的异常糖基化与肿瘤发生、发展的关系已经成为恶性肿瘤诊断与治疗的研究热点。肝脏是蛋白质合成、加工的重要场所，与血清蛋白的糖基化状态密切相关。肝脏疾病会不同程度地影响糖蛋白的糖基化的水平。已有研究证实，肝病患者血清转铁蛋白、α1酸性糖蛋白、胎球蛋白A、甲胎蛋白、α2-巨球蛋白等多天线糖链结构出现明显异常。转铁蛋白(transferrin，TRF)是血清中含量较高的糖蛋白之一，其浓度非常稳定，常维持在2～3g/L。转铁蛋白为血清中运输铁离子的主要蛋白，由679个氨基酸组成的单一肽链构成，其相对分子质量为79000，含糖量约为6％。转铁蛋白含有2个N-linked糖基化位点(Asn-413和Asn-611)和1个O-linked糖基化位点(Ser-32)。糖链主要由N-乙酰氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖和唾液酸4种糖构成。转铁蛋白的糖链结构在肽链折叠及与转运铁离子等生理功能中起关键作用，无糖链的转铁蛋白分子不能形成正常二聚体，在胞内易被降解而无法运载铁离子；而糖链结构异常的转铁蛋白在癌变及血液病变者的血清中大量出现。近年来研究发现：原发性肝癌及慢性肝病患者血清中多天线糖链结构TRF增加，含核心岩藻糖及含平分型N-乙酰氨基葡萄糖糖链结构TRF出现，且原发性肝癌患者血清中多天线糖链结构TRF含量高于肝硬化患者，DSA结合型TRF有望成为原发性肝癌的诊断指标。α1-酸性糖蛋白(α1-acidglycoprotein，α1-AG或AGP)又称粘蛋白，是人类血清中含糖量最高、酸性最强的糖蛋白，含糖量高达40％，主要由肝脏合成，某些肿瘤组织也能合成。已报道AGP肽链上有5个N-糖基化位点(N15，N38，N58，N75及N85)，富含唾液酸、岩藻糖及多天线糖链分支结构。AGP的糖基化水平与炎症发生相关，特别是慢性肝脏炎症反应相关。在慢性肝炎患者血清中，AGP浓度增多，同时AGP中核心岩藻糖及三天线糖链结构显著增多。胎球蛋白A(fetuinA)也被称为2-HS糖蛋白(2-Heremans-Schmidglycoprotein，AHSG)，是由3号染色体上的AHSG基因编码。人胎球蛋白A主要是由肝脏细胞分泌。在血浆中，胎球蛋白A的分子量为59KDa，由二硫键项链的两个多肽链组成，含两个N-末端半胱氨酸蛋白酶抑制区域和一个较小的C-端构成。胎球蛋白A分子量大小与糖部分有关，含两个N-糖，3个O-糖结构，胎球蛋白的N-聚糖主要有非岩藻糖化的双天线、板平分型GIcNAc的三天线、四天线结构，以及GalNAc和高甘露醇型。本实验室也发现：肝癌、肝硬化患者血清岩藻糖基化FetuinA水平明显高于HBV无症状携带者与正常健康对照组，并对肝硬化患者表现出很好的诊断价值。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一个胚胎特异的血清α-球蛋白，其分子结构已经比较明确：是一个糖蛋白，含有1个有寡聚糖组成的糖基，相对分子量为68KDa。AFP的基本N-聚糖结构为唾液酸、N-乙酰葡糖胺、半乳糖和甘露糖。不同来源的AFP具有相同的蛋白质部分和不同的聚糖结构。DSA可以识别多于二天线偏二天线聚糖结构。肝癌细胞来源的AFP比人脐带血来源的AFP具有较多核心岩藻糖基化、多天线、α2，3唾液酸和较少α2，6唾液酸结构。AFP的生物学功能非常复杂，其在胎儿和肿瘤生长中的生理作用以及得到证实，是的AFP在人类疾病诊断和治疗中发挥重要作用。AFP在正常成人血清几乎检测不到或及其微量，而在成人HCC患者中大约70％～85％都有AFP表达，此外有研究把AFP作为癌症预后不良的预示指标。α2-巨球蛋白(alpha2-macroglobulin，α2-MG)是血浆中相对分子量最大的蛋白质，是血浆中含量丰富的大分子糖蛋白，含糖量约8％。主要由肝细胞与单核-巨噬细胞系统合成，占人类总血浆蛋白的8％～10％。α2-MG是由4个相同的亚基组成的同源四聚体结构，有8个潜在的N-糖基化位点，分别位于N55、N70、N247、N396、N410、N869、N991和N1424。α2-MG作为机体重要的急性时相反应蛋白，参与多种疾病的病理生理过程。临床上α2-MG水平升高常见于肝硬化和糖尿病患者，降低则常见于急性胰腺炎患者。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有多天线糖链结构特定蛋白的检测方法，并将该方法用于检测原发性肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)、慢性乙型肝炎(CHB)和健康对照(HC)中具有多天线糖链结构的特定蛋白，特别是对HBV感染相关HCC的辅助诊断及分层管理。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了一种检测血清多天线糖链结构特定蛋白水平的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)抗体-凝集素夹心法检测血清多天线糖链结构特定蛋白(DSA-SP)；(2)结合血清相应特定蛋白总量(SP)，计算DSA-SP/SP。其中，血清样品是离体样品，优选是人血清样品。本专利技术的方法不包括从生物体内取样的步骤。优选其中，所述的凝集素是曼陀罗凝集素(DSA)及其检测所用工作浓度；优选其中，所述的DSA-SP检测体系是抗体-凝集素夹心法；优选其中，该方法进一步包括多天线糖链结构特定蛋白/特定蛋白总量的比值及参考值的建立与比较；优选其中，DSA-SP及DSA-SP/SP比值对于临床原发性肝细胞癌与非原发性肝细胞癌的区分、DSA-SP及DSA-SP/SP比值对于原发性肝细胞癌进展程度的区分。该方法不包括检测血清样品的HBV感染性。同时本专利技术的方法不能区分健康人群和慢性乙肝患者，而对于其他疾病患者(如：HIV感染者)也不具有诊断依据。在第二方面，本专利技术提供了用于本专利技术第一方面的方法的检测系统，其特征在于该检测系统中凝集素种类及浓度的选择、抗体种类及浓度的选择。附图说明图1：血清多天线糖链结构转铁蛋白的测定结果图2：血清总转铁蛋白的测定结果图3：血清多天线糖链结构转铁蛋与总转铁蛋白比值结果图4：HCC与LC鉴别时，DSA-TRF/TRF与AFP的ROC曲线图5：HCC与CHB鉴别时，DSA-TRF/TRF与AFP的ROC曲线具体实施方式实施案例以特定蛋白中的转铁蛋白为例。下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细描述。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。在本专利技术中，通过检测具有多天线糖链结构转铁蛋白(DSA-TRF)含量和转铁蛋白(TRF)总量，分别将DSA-TRF以及DSA-TRF与总TRF的比值(简称为DSA-TRF/TRF)作为诊断指标对原发性肝癌-非原发性肝癌患者进行区分度评估。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多天线糖链结构的血清特定蛋白的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)抗体‑凝集素夹心检测法检测血清具有多天线糖链结构的特定蛋白(DSA‑SP)；(2)同时结合检测血清中相应特定蛋白SP的总量，计算DSA‑SP/SP。
【技术特征摘要】
1.一种多天线糖链结构的血清特定蛋白的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)抗体-凝集素夹心检测法检测血清具有多天线糖链结构的特定蛋白(DSA-SP)；(2)同时结合检测血清中相应特定蛋白SP的总量，计算DSA-SP/SP。2.根据权利要求1所述的多天线糖链结构特定蛋白检测方法，其特征在于，所述的凝集素是曼陀罗凝集素(DSA)。3.根据权利要求1所述的多天线糖链结构特定蛋白检测方法及检测体系，其特征在于，采用特定蛋白抗体用于捕获检测、DSA用于标记检测的抗体-凝集素夹心检测体系。4.根据权利要求1所述的多天线糖链结构特定蛋白比值的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：高春芳，冯惠娟，关雯倩，房萌，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院，高春芳，
类型：发明
国别省市：上海,31
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