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一种检测血管内皮细胞中乙酰化PINK1的方法技术

技术编号:20094213 阅读:57 留言:0更新日期:2019-01-15 12:53
本发明专利技术公开了一种血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸,主要由样品垫,结合垫,吸水垫,底板,硝酸纤维膜五部分组成,所述硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线,靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体,作为检测线,另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体,作为标准浓度显色对照线,两条线相距4~7mm;所述结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。

A Method for Detecting Acetylated PINK1 in Vascular Endothelial Cells

The invention discloses a semi-quantitative test paper for acetylated PINK1 protein in vascular endothelial cells, which mainly consists of five parts: sample pad, binding pad, water absorbent pad, bottom plate and nitric acid fiber membrane. Two parallel antibody capture lines are drawn on the nitric acid fiber membrane, and one near the binding pad contains acetylated PINK1 protein in the first anti-vascular endothelial cells at a determined concentration. I monoclonal antibody, as a detection line, and the other one containing sheep anti-rabbit IgG antibody at a determined concentration, as a standard concentration color contrast line, the two lines are 4-7 mm apart; the two substances of acetylated PINK1 protein I monoclonal antibody and gold-labeled rabbit IgG in the second anti-vascular endothelial cell coated with colloidal gold or color latex are described.

【技术实现步骤摘要】
一种检测血管内皮细胞中乙酰化PINK1的方法
本专利技术涉及一种检测血管内皮细胞中乙酰化PINK1的方法,具体涉及一种快速便捷的荧光免疫层析快速检测方法及乙酰化PINKI蛋白半定量检测试纸。
技术介绍
我国今年来代谢性疾病发病率快速上升,该疾病往往是造成血管病变的主要元凶,如高脂血症、糖尿病及高尿酸血症等。研究表明2型糖尿病(T2DM)患者心血管疾病的风险,比非糖尿病患者要高2-4倍,而中年糖尿病人群中心血管疾病的发生率可高达44%,且糖尿病人群心血管疾病的死亡率达到了2.7%。脂肪组织作为一个新的内分泌器官已被重新认识,肥胖,尤其是中心性肥胖,堆积的内脏脂肪会分泌多种生物活性物质;另外,高胆固醇血症时,氧自由基过多形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),这些有害物质对血管内皮细胞都具有毒性作用,是导致血管内皮功能障碍的重要因素。血管内皮损伤既是众多慢性疾病的结果,又是其它疾病的起始。糖尿病的一些慢性并发症均与内皮血管损伤有关,如糖尿病视网膜病变,神经病变,糖尿病肾病,糖尿病足等。已有研究表明血管内皮细胞受损并内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因子,即动脉粥样硬化是动脉壁对内皮细胞损伤的一种慢性炎症反应,反映血管内皮功能的相关因子,同样也能预测动脉粥样硬化的严重程度。血管内皮的修复也已成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。然而,目前还没有有效的方法早期检测血管内皮损伤。临床上目前用来检测血管内皮损伤的方法主要是颈动脉多普勒彩色超声波检查,此法虽能检测动脉内膜增厚及斑块形成,但此时内皮细胞的损伤已经是不可逆了。之前有以循环内皮细胞(CEC)数量来衡量血管内皮的损伤程度,此法的缺点是不能准确反映内皮细胞的功能状态。这两种方法都不能准确地早期发现血管内皮损伤。本课题所建立的方法将克服这一不足,申请者将在循环内皮细胞中进一步观察检测细胞线粒体的功能状态,以确定内皮细胞损伤。综上所述,通过循环内皮细胞线粒体功能状况的测定能确定内皮功能受损状况,对早期诊断具有重大意义。本项目通过仪器机械结构、电子技术、光路技术及软件研究,乙酰化PINKI蛋白检测试剂制备技术研究和临床试验研究,掌握荧光免疫层析快速检测分析仪及半定量检测试纸条的关键制备技术和临床应用技术,开发出低成本快速便捷的荧光免疫层析快速检测仪器及乙酰化PINKI蛋白半定量检测试纸条,满足我国临床对于心血管疾病早期预警的需求。
技术实现思路
乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它是在乙酰基转移酶的催化下,在蛋白质特定的位置添加乙酰基的过程,是细胞通过翻译后修饰控制基因表达、蛋白质活性和调节细胞内信号转导等生物活动的一种机制。乙酰化对磷酸化有调节作用。磷酸化也是一种重要的蛋白质翻译后修饰,PINK1的磷酸化是启动PINK1,P-Ub,Parkin通路的活性状态,PINK1的磷酸化位点是Ser228/Ser402或Thr257,而邻近激酶功能域(KinaseDomain)中的Lys347/Lys369是潜在的乙酰化位点。有研究报道PCAF可以介导IL-6等在赖氨酸位点的乙酰化。本专利技术人在进一步的预实验中发现,在HAEC细胞,PCAF介导IL-6乙酰化PINK1,其结果是干扰了PINK1的磷酸化并抑制线粒体自噬。同时还发现脂毒性物质ox-LDL对线粒体自噬也有抑制作用。IL-6通过PCAF乙酰化PINK1以干扰PINK1磷酸化,进而抑制线粒体自噬,导致线粒体功能障碍。研究发现,代谢性疾病早期出现代谢紊乱时就与线粒体功能障碍密切相关。有报道,2型糖尿病早期已经出现线粒体功能障碍,此时NAD+依赖的去乙酰化酶(SIRT1-7)及PPAR增强因子1α(PGC-1α)活性下降,不能维持线粒体内稳定,其结果是线粒体内脂肪酸β氧化障碍,骨骼肌、脂肪组织和肝脏脂质蓄积,导致胰岛素抵抗和肥胖[14]。另外,氧化应激,Tp53inp1功能丧失或PINK1/Parkin通路异常而至线粒体自噬缺损,都与胰岛素抵抗和肥胖的发生相关[15]。有研究表明,作为心血管疾病第三大主要原因的周围动脉疾病(PAD),其发生和发展与线粒体呼吸链状况密切相关[16]。那么代谢紊乱是如何损害血管内皮细胞线粒体自噬的,线粒体自噬损伤后是通过什么途径造成血管内皮功能障碍的,目前尚未完全阐明。这也是本研究所聚焦的关键问题所在。线粒体是能量代谢的主要细胞器,脂肪酸,葡萄糖和氨基酸通过线粒体内三羧酸循环和内膜氧化磷酸化产生大量ATP,同时,也产生活性氧(ROS)和热量。因此,线粒体功能状况与机体的代谢,健康、疾病和寿命关系密切。一旦线粒体功能障碍,线粒体将无限制产生ROS,这些ROS将损害生物大分子,并出现能量供应障碍,进而影响多个生物过程。自噬(Autophagy)是细胞降解清除自身细胞质蛋白或细胞器的过程,藉此为细胞本身提供能量和实现某些细胞器的更新。是维持细胞内环境稳定的主要细胞生物学行为。线粒体自噬(Mitophagy)是针对线粒体发生的细胞自噬,参与线粒体自噬的自噬相关蛋白(autophagy-relatedprotein,ATG)除传统的LC3(AGT8)和Beclin1(ATG6)外,酵母线粒体外膜上的ATG32为诱导线粒体自噬所必须,在人类及哺乳类动物Bcl2-L-13担当了ATG32的功能[17,18]。附图说明图1.荧光免疫层析检测试纸条检测仪技术路线图图2.PINK1结构示意图。T257,S228和S402为磷酸化位点,L347和L369为乙酰化位点。图3.PCAF介导IL-6乙酰化PINK1抑制PINK1磷酸化。A.PCAF乙酰化PINK1。B.IL-6乙酰化PINK1(L347/L369)。C.PCAF介导乙酰化PINK1阻止PINK1磷酸化。图4.IL-6和ox-LDL抑制HAEC细胞线粒体自噬。A:荧光标记慢病毒检测;B:慢病毒检测的统计分析,独立实验进行4次;C:电镜检测线粒体自噬,红色箭头为正常线粒体,绿色箭头为正常线粒体自噬,黄色箭头为损伤(肿胀)的线粒体,IL-6和ox-LDL处理未见线粒体自噬;D:WesternBlot检测线粒体自噬相关蛋白。图5.mtDNA在血管内皮和HAEC细胞中的含量。RT-qPCRA分析,A.糖尿病和高脂血症病人动脉内皮中的含量,B.db/db模型鼠主动脉内皮中的含量,C.IL-6和ox-LDL处理的HAEC细胞mtDNA的含量。*分别与对照组人群,野生型(WT)鼠对照组和HAEC细胞对照组相比,P<0.01.图6.IL-6和ox-LDL诱导HAEC细胞发生EndoMT。图7.IL-6和ox-LDL诱导HAEC细胞高表达α-SMA和CollagenIV。A.免疫荧光分析ox-LDL诱导HAEC细胞高表达α-SMA。B.WesternBlot分析IL-6和ox-LDL诱导HAEC细胞高表达α-SMA和CollagenIV。具体实施方式(1)乙酰化PINK1损害线粒体自噬进而导致血管内皮功能损伤的研究1)乙酰化PINK1干扰PINK1磷酸化进而损害线粒体自噬收集结肠癌伴糖尿病和高脂血症患者肿瘤切除的癌旁肠系膜动脉组织,留取病人的血液标本,收集病史资料。建立高脂喂养加STZ处理的糖尿病模型鼠和db/db糖尿病模型鼠,用免疫组化法、免疫荧光法、real本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸,主要由样品垫,结合垫,吸水垫,底板,硝酸纤维膜五部分组成,其特征在于:所述硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线,靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体,作为检测线,另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体,作为标准浓度显色对照线,两条线相距4~7mm;所述结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。

【技术特征摘要】
1.一种血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸,主要由样品垫,结合垫,吸水垫,底板,硝酸纤维膜五部分组成,其特征在于:所述硝酸纤维膜上分别划有两条平行的抗体捕获线,靠近结合垫的一条含有经过确定了浓度的第一抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体,作为检测线,另一条含有经确定了浓度的羊抗兔IgG抗体,作为标准浓度显色对照线,两条线相距4~7mm;所述结合垫喷有胶体金或彩色乳胶标记的第二抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体和金标兔IgG两种物质。2.如权利要求1所述的血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸,其特征在于,所述硝酸纤维膜与上部的吸水垫,硝酸纤维膜与下端的结合垫,结合垫与下部的样品垫之间分别部分重叠交接。3.如权利要求1或2所述的血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸,其特征在于,所用的胶体金或彩色乳胶标记的第二抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单克隆抗体的金颗粒或乳胶大小在20nm~120nm间。4.使用如权利要求1至3任一项所述的血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白半定量检测试纸的制备方法,其特征在于包括以下步骤:选择两株抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I鼠源性特异单克隆抗体,即抗血管内皮细胞中乙酰化PINK1蛋白I单抗1和抗血管内皮细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员:步世忠陈晓敏方亮
申请(专利权)人:宁波大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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