一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及疫苗领域，公开了一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，包括：A）病毒的裂解和预分离；B）SDS‑PAGE分离与LC‑MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白；D）稳定表达B5R，D8L和K2L的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。本发明专利技术建立了一整套筛选和鉴定具有TLR2配体活力的牛痘病毒蛋白亚组分的方法，并鉴定出病毒蛋白D8L具有TLR2配体活力，并且可用于制备抗病毒感染和抗肿瘤的TLR类疫苗佐剂。

Screening and identification of TLR vaccine adjuvants

The invention relates to the field of vaccines, and discloses a method for screening and identifying TLR vaccine adjuvants, including: A) virus lysis and pre-isolation; B) SDS PAGE isolation and LC MS identification of specific viral subcomponent proteins; C) electroelution separation of viral subcomponent proteins; D) construction of 293T cell lines stably expressing B5R, D8L and K2L, and determination of TLR2 ligand activity. The invention establishes a set of methods for screening and identifying subcomponents of vaccinia virus protein with TLR2 ligand activity, and identifies that the virus protein D8L has TLR2 ligand activity, and can be used to prepare TLR vaccine adjuvants for anti-virus infection and anti-tumor.

【技术实现步骤摘要】
一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法
本专利技术涉及疫苗领域，一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法。
技术介绍
宿主响应病毒感染的免疫应答机制，主要通过模式识别受体（PRRs）来识别不同病毒中的相关配体，这些配体称为病原相关分子模式（PAMPs），包括病毒蛋白，DNA，RNA等。与病毒的DNA和RNA不同，病毒蛋白主要被TLR家族蛋白所识别，包括TLR2和TLR4。先天免疫细胞，例如巨噬细胞和DCs，均表达TLR2和TLR4，因此能被相关病毒激活，并且分泌多种炎症因子，导致宿主免疫反应的激活。我们的研究结果表明牛痘病毒（VV）可以激活DC细胞（DCs）或巨噬细胞内的TLR2-MyD88信号通路，引起细胞前炎症因子的分泌增加以及T细胞反应的增强。但是，TLR2具体被病毒颗粒中的何种分子激活仍不清楚。疫苗在传染病的预防与控制过程中发挥着重要作用。例如，牛痘病毒疫苗用于天花病毒的预防，使天花病毒自上世纪70年代之后几乎绝迹。传统的牛痘病毒疫苗主要是采用活体的牛痘病毒制备而成，常伴有较高频率的毒副作用，尤其对于患有湿疹和免疫缺陷的病人，甚至可能具有潜在危害。相比之下，一种更安全的替代方法是使用高度纯化的重组蛋白疫苗。随着新型重组蛋白疫苗的发展，蛋白疫苗也广泛用于其他恶性疾病的治疗，如肿瘤的治疗过程中。其原理是将肿瘤抗原以肿瘤相关蛋白或多肽的形式导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。目前研究的大多数疫苗是基于高度纯化的重组蛋白或者病原亚基。但是，许多重组蛋白激活保护性免疫反应的能力较弱，因此蛋白疫苗需要与佐剂共同使用来增强抗原的免疫原性。佐剂是一种非特异性的免疫增强剂。一般认为，佐剂的种类直接决定了免疫的效果和免疫反应的类型，但是其中的作用机制仍不清楚。改良疫苗和佐剂的组分以提升免疫效果是当务之急。以牛痘病毒为例，牛痘病毒颗粒中共含有约30种蛋白组分，相关研究鉴定出多种病毒表面抗原基因在宿主免疫应答中发挥功能，但是这些抗原蛋白通过何种机制激活宿主免疫应答，以及是否需要疫苗佐剂来实现免疫保护并不清楚。因此，需要以某些特定指标为基准建立一整套分析和鉴定牛痘病毒中具有疫苗佐剂活性的蛋白亚组分的技术方法，并以此为基础开发更安全高效的适用于抗病毒和抗肿瘤的疫苗佐剂。。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术建立了一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，具体地，本专利技术建立了一整套筛选和鉴定具有TLR2配体活力的牛痘病毒蛋白亚组分的技术方法，并鉴定出病毒蛋白D8L和K2L具有TLR2配体活力。其中D8L的TLR2配体活力较强，并且单独用重组蛋白D8L免疫小鼠，可以使小鼠体内的免疫应答增强和产生保护性抗体。因此鉴定出的病毒重组蛋白D8L既是一类TLR类疫苗佐剂，同时也是一种具有免疫原性的病毒抗原，可用于制备抗天花病毒感染的蛋白疫苗。由于TLR2通过识别多种病原相关分子模式，引起机体的先天免疫或体液免疫，该技术也适用于针对其他病毒或病原的TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定。此外，肿瘤细胞携带的肿瘤相关抗原也能被TLR类受体识别，因此TLR类疫苗佐剂也可用于激发人体对肿瘤细胞的免疫能力，起到抗肿瘤的作用。本专利技术的具体技术方案为：一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：A）病毒的裂解和预分离；B）SDS-PAGE分离与LC-MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；D）稳定表达病毒重组蛋白的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。作为优选，所述病毒重组蛋白为B5R、D8L或K2L。病毒表面的病原相关分子模式（PAMPs）可以被宿主免疫细胞表面的TLR家族受体识别，引起宿主的免疫应答。本专利技术团队的前期研究发现，牛痘病毒引起的宿主的免疫应答增强，包括DC的激活和成熟，以及T细胞反应等，均依赖于TLR2通路的激活。因此，借助TLR2通路的活力检测，可以分析和鉴定哪些病毒蛋白组分能激活宿主免疫应答。因此在此基础上，本专利技术建立了一整套筛选和鉴定具有TLR2配体活力的牛痘病毒蛋白亚组分的技术方法，并鉴定出病毒蛋白D8L和K2L具有TLR2配体活力，其中D8L的TLR2配体活力较强，并且单独用重组蛋白D8L免疫小鼠，可以使小鼠体内的免疫应答增强和产生保护性抗体。因此鉴定出的病毒重组蛋白D8L可以同时作为蛋白牛痘疫苗和TLR类疫苗佐剂。该技术也适用于其他抗病毒和抗肿瘤的TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定。作为优选，步骤A）具体为：1）用温和的去垢剂TritonX-100裂解牛痘病毒，得到病毒裂解液。TritonX-100是一种温和非变性的提取剂，可以有效保存生物活性。2）用带有分子筛的透析卡透析去除病毒裂解液中的去垢剂成分。3）对病毒裂解液离心处理，去除不溶性沉淀，并测定上清液中的蛋白浓度。4）用分子筛将蛋白分成<30kD，30-100kD和>100kD三种病毒亚组分蛋白。5）分别测定每种病毒亚组分蛋白的蛋白浓度，取部分各病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定。6）根据步骤D）中的方法测定每种病毒亚组分蛋白的TLR2配体活力，筛选具有TLR2配体活力的病毒亚组分蛋白用于后续的分离和鉴定步骤。作为优选，步骤A）的步骤3）中，离心条件为13000-17000g，20-40min。作为优选，步骤B）具体为：1）将100~200μg步骤A）中分离得到的病毒亚组分蛋白，用非还原和非变性的SDS-PAGE分离。该方法可以在不破坏蛋白结构中的二硫键的情况下，根据分子量大小分离蛋白质，从而保护蛋白质可能具有的抗原性质。2）考马斯亮蓝法染色，区分不同分子量的蛋白条带；3）拍照并切下每个条带，取部分胶块，用胶内酶解法将胶内的蛋白质消化成多肽片段，接着用LC-MS鉴定每个条带的多肽序列和蛋白质种类；4）剩余胶块用于电洗脱法分离病毒亚组分蛋白。作为优选，步骤C）具体为：1）用电洗脱仪对步骤B）中剩余胶块进行电洗脱，电洗脱条件为：55-65V恒压1-5℃过夜；2）根据分子量选择30kD的分子筛透析，去除30kD以下的病毒亚组分蛋白和电泳缓冲液中的缓冲盐成分；3）将病毒亚组分蛋白用10kD分子筛浓缩成80-120μL，测定浓度后，可用于TLR2配体活力的测定。用步骤B）方法分离所得的蛋白质保留自身的大部分抗原性质，因此可用电洗脱法将蛋白从胶内洗脱出来，在体外处理表达TLR2报告基因的细胞，以此筛选具有TLR2配体活力的病毒蛋白亚组分。作为优选，步骤D）具体为：1）在体外培养和扩增稳定表达人TLR2或TLR4的HEK293细胞：HEK293，HEK293-hTLR2/CD14，HEK293-hTLR4/CD14和HEK293-hCD14；HEK293和HEK293-hCD14作为不表达TLR2或TLR4的阴性对照。2）将步骤A）中和C）中分离得到的病毒亚组分蛋白稀释成不同浓度，分别刺激以上各种细胞。3）刺激15-20h后，用ELISA试剂盒检测上清中人IL-8的分泌，培养基中的TLR配体与HEK293细胞中的TLR2或TLR4结合后，会激活NF-κB信号通路和引起人IL-8的表达和分泌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A）病毒的裂解和预分离；B）SDS‑PAGE分离与LC‑MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；D）稳定表达病毒重组蛋白的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。

【技术特征摘要】
1.一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A）病毒的裂解和预分离；B）SDS-PAGE分离与LC-MS鉴定具体的病毒亚组分蛋白；C）电洗脱法分离病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；D）稳定表达病毒重组蛋白的293T细胞系的构建以及TLR2配体活力的测定。2.如权利要求1所述的一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述病毒重组蛋白为B5R、D8L或K2L。3.如权利要求1所述的一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤A）具体为：1）用温和的去垢剂TritonX-100裂解牛痘病毒，得到病毒裂解液；2）用带有分子筛的透析卡透析去除病毒裂解液中的去垢剂成分；3）对病毒裂解液离心处理，去除不溶性沉淀，并测定上清液中的蛋白浓度；4）用分子筛将蛋白分成<30kD，30-100kD和>100kD三种病毒亚组分蛋白；5）分别测定每种病毒亚组分蛋白的蛋白浓度，取部分各病毒亚组分蛋白，用于TLR2配体活力测定；6）根据步骤D）中的方法测定每种病毒亚组分蛋白的TLR2配体活力，筛选具有TLR2配体活力的病毒亚组分蛋白用于后续的分离和鉴定步骤。4.如权利要求3所述的一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤A）的步骤3）中，离心条件为13000-17000g，20-40min。5.如权利要求3所述的一种TLR类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法，其特征在于，步骤B）具体为：1）将100~200μg步骤A）中分离得到的病毒亚组分蛋白，用非还原和非变性的SDS-PAGE分离；2）考马斯亮蓝法染色，区分不同分子量的蛋白条带；3）拍照并切下每个条带，取部分胶块，用胶内酶解法将胶内的蛋白质消化成多肽片段，接着用LC-MS鉴定每个条带的多肽序列和蛋白质种类；4）剩余胶块用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文君，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33