一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用制造技术

本发明专利技术属于免疫检测技术领域，具体涉及一种快速检测β‑淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用。所述的快速检测β‑淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，包含设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜、包被量子点微球偶联Aβ40和Aβ42多克隆抗体的玻璃纤维膜、底板、样品垫和吸水垫。本发明专利技术提供的快速检测β‑淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条通过量子点免疫层析技术，可实现一次反应同时检测Aβ40、Aβ42抗原指标，避免了不同蛋白互相产生交叉的问题，检测时间短，灵敏度高于酶联免疫方法10倍以上，特异性强，反应速度快，准确性高，定量准确。

Quantum dot immunochromatographic strip for rapid detection of beta-amyloid protein and its application

The invention belongs to the field of immunoassay technology, in particular to a quantum dot immunochromatographic strip for rapid detection of beta amyloid protein and its application. The quantum dot immunochromatographic strip for rapid detection of beta amyloid protein comprises a cellulose nitrate membrane with a detection and quality control region, a glass fiber membrane coated with quantum dot microspheres coupled with polyclonal antibodies Abeta 40 and Abeta 42, a bottom plate, a sample pad and a water absorbent pad. The quantum dot immunochromatographic strip for rapid detection of beta amyloid protein provided by the invention can simultaneously detect the antigen indexes of Abeta 40 and Abeta 42 in a single reaction by means of quantum dot immunochromatographic technology, avoiding the cross-over problem of different proteins, with short detection time, higher sensitivity than that of enzyme-linked immunosorbent method by more than 10 times, strong specificity, fast reaction speed and high accuracy. The amount is accurate.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，由巴伐利亚的神经病理学家阿尔茨海默于1907年首先发现，并以其名字命名，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。阿尔茨海默病是老年痴呆最常见的一种类型，约占所有痴呆的50～60％，据统计在西方国家，大于或等于85岁年龄组的患病率在24～33％之间，虽然发展中国家缺少权威性和代表性数字统计，但是估计世界上60％的痴呆患者存在于发展中国家。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β-淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。因此β-淀粉样蛋白可以作为阿尔茨海默病为代表的以血管增生为特点的疾病诊断指标。1930年，Divry用刚果红对AD病人脑中的损害区域进行能够染色，成功地使沉积在细胞外的老年斑着色，进而发现老年斑的主要成分是一种嗜刚果红的淀粉样蛋白，1984年Glenner等分别成功地完成了对这种蛋白的分离和测序工作，发现此蛋白是由39～43个氨基酸残基组成，因其具有一个β片层的二级结构，遂命名β-淀粉样蛋白，简称Aβ。脑内Aβ来源于其前体物质β淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)。APP是一种跨膜蛋白质，在体内各种组织广泛存在，而在脑组织的表达最高，在生理条件下，多数APP由A2分泌酶裂解成可溶性的App肽，App肽在进一步由C2分泌酶裂解产生P3极少部分APP在胞质溶酶体经β2分泌酶和C2分泌酶作用裂解为Aβ，从App代谢为β淀粉样蛋白过程分为两步：首先β2分泌酶在Aβ的N末端裂解APP，产生可溶的分泌性的APP衍生物APPS2β和贯穿膜成分的C末端片断，C末端片断进一步由C2分泌酶裂解为Aβ，Aβ有40个氨基酸和42个氨基酸2种形式，其中Aβ42容易引起聚集，具有较强的细胞毒性，在某些病理条件下，APP主要经β2分泌酶和C2分泌酶顺序剪切产生过多的Aβ导致AD病，C2分泌酶在Aβ产生中起非常重要的作用，决定了产生的Aβ42在其中所占的比例。β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)分子量约4KDa，由β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein，APP)水解而来，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内Aβ最常见的亚型是Aβ40和Aβ42。在人脑脊液和血中，Aβ40分别比Aβ42的含量水平高10倍和1.5倍，Aβ42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成Aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用。Aβ的沉积不仅与神经元的退行性病变有关，而且可以激活一系列病理事件，包括星型胶质细胞和小胶质细胞的激活、血脑屏障的破环和微循环的变化等，是AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因。研究人员认为，β-淀粉样蛋白在脑神经细胞内部的早期蓄积表明，在脑神经细胞外还未出现β-淀粉样蛋白蓄积时，阿尔茨海默氏症就已经出现。这一发现或有助于提早诊断、治疗阿尔茨海默氏症，从而尽可能延缓病情恶化。量子点作为一种新型的无机纳米荧光材料被广泛应用于生物和医学领域，在细胞标记、生物分子检测、免疫分析等方面都取得了许多重要成果。与传统有机荧光染料相比，量子点具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、抗光漂白性强、荧光强度高等显著优点。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，量子点层析技术即为其中一种，近两年新发展的量子点快速测定试纸条主要适用于急诊检验、小型化验室或家中自测，传统的检测手段存在操作繁琐，时间长，需要昂贵的仪器设备等缺陷，量子点由于其优良的荧光性能，近年来在生物化学、细胞生物学、分子生物学等研究领域都显示了极其广阔的应用前景。与传统有机荧光染料相比，量子点作为荧光探针有不可比拟的优越性：①激发光谱宽而连续，传统有机荧光试剂激发光谱较窄，不同的有机荧光染料需要不同波长激发光激发。而量子点能吸收所有比它第一发射波长更短波长的光，因此不同颜色的量子点能用同一光同时激发，大大简化了实际检测过程，降低了对激发光源的要求。②发射峰窄而对称，量子点的荧光发射光谱峰形狭窄而对称，半高峰宽(fwhm)通常只有40nm甚至更小，且在长波方向没有明显的拖尾现象，可以同时使用不同发射峰的量子点，而发射峰不出现重叠。这种性质使得量子点有可能用作多彩编码应用于生物荧光标记中。③光稳定性强，在持续光激发下，有机荧光染料的荧光衰减迅速，容易被漂白，这在很大程度上限制了它们在生物荧光标记上的应用。而量子点由于属于无机纳米颗粒，因此是一种非常稳定的荧光物质，其抗光漂白性要远远好于有机染料。④发射波长可“调谐”，有机荧光染料试剂中，只有极少数的化合物发射波长可达700nm以上(如菁类荧光染料)，而量子点通过改变其尺寸和化学组成可以使其发射光谱覆盖远紫外到近红外的波长区域，从而弥补了普通荧光分子在近红外光谱区品种少的不足，量子点发光性质的可控性以及延续性，对于其在各个领域的应用十分重要。⑤荧光强度高，量子点具有非常高的激发重叠区(excitationcross-sections)，这就意味着他们能吸收大量的激发光；量子点还具有很高的量子产率，因此他们能发射大量他们所吸收的光。这两个因素都导致量子点的亮度很高，单个量子点也能很容易地被检测到，相对有机染料提高了检测的灵敏度，这为考察单个生物分子的活动情况以及他们之间的相互作用提供了有利的工具。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，该试纸条基于不同粒径的量子点的发光波长不同的特点，采用量子点方法检测β-淀粉样蛋白，一次实验，可同时测定β-淀粉样蛋白40(Aβ40)和β-淀粉样蛋白42(Aβ42)两个亚基，该试纸条具有灵敏度高，特异性强，反应速度快，可作为家庭快速检测产品，具有广阔的应用前景。本专利技术的另一目的在于提供上述快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，包含设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜、包被量子点微球偶联Aβ40和Aβ42多克隆抗体的玻璃纤维膜；所述的设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜依次设有Aβ40单克隆抗体、Aβ42单克隆抗体和DNP抗体，形成检测区T1、检测区T2和质控区C；所述的检测区T1和检测区T2之间的间距优选为0.5cm；所述的检测区T2和质控区C之间的间距优选为0.5cm；所述的设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜的制备方法，包含如下步骤：(1)将Aβ40单克隆抗体、Aβ42单克隆抗体用含有海藻糖的磷酸盐缓冲液分别稀释至浓度为1.0～2.5mg/mL，DNP抗体稀释至浓度为0.75本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测β‑淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于包含设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜、包被量子点微球偶联Aβ40和Aβ42多克隆抗体的玻璃纤维膜；所述的设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜依次设有Aβ40单克隆抗体、Aβ42单克隆抗体和DNP抗体，形成检测区T1、检测区T2和质控区C。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于包含设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜、包被量子点微球偶联Aβ40和Aβ42多克隆抗体的玻璃纤维膜；所述的设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜依次设有Aβ40单克隆抗体、Aβ42单克隆抗体和DNP抗体，形成检测区T1、检测区T2和质控区C。2.根据权利要求1所述的快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于：所述的检测区T1和检测区T2之间的间距为0.5cm；所述的检测区T2和质控区C之间的间距为0.5cm。3.根据权利要求1所述的快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于：所述的设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜的制备方法，包含如下步骤：(1)将Aβ40单克隆抗体、Aβ42单克隆抗体用含有海藻糖的磷酸盐缓冲液分别稀释至浓度为1.0～2.5mg/mL，DNP抗体稀释至浓度为0.75～2.5mg/mL，得到β40单克隆抗体工作液、Aβ42单克隆抗体工作液和DNP抗体工作液；(2)将步骤(1)制得的β40单克隆抗体工作液、Aβ42单克隆抗体工作液和DNP抗体工作液分别在硝酸纤维素膜上划膜，形成检测区T1、检测区T2和质控区C，干燥，得到设有检测区和质控区的硝酸纤维素膜。4.根据权利要求3所述的快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于：步骤(1)中所述的含有海藻糖的磷酸盐缓冲液为含有质量分数为1％海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.5～8.5。5.根据权利要求1所述的快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条，其特征在于：所述的包被量子点微球偶联Aβ40和Aβ42多克隆抗体的玻璃纤维膜的制备方法，包含如下步骤：(1)QD655量子点微球标记Aβ40多克隆抗体、QD565量子点微球标记Aβ42多克隆抗体将QD655量子点微球、QD565量子点微球分别用活化缓冲液洗涤并稀释，得到QD655量子点微球溶液、QD565量子点微球溶液；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与QD655量子点微球溶液、QD565量子点微球溶液分别混合，25℃±0.1℃振荡30～60min，离心，弃上清，然后用偶联液洗涤，得到洗涤后的QD655量子点微球、QD565量子点微球；然后按照每毫克量子点微球加入10μg抗体蛋白的配比，在洗涤后的QD655量子点微球、QD565量子点微球中分别加入Aβ40多克隆抗体、Aβ42多克隆抗体，2～8℃振荡18～24h；加入封闭液25℃±0.1℃振荡60～120min，离心，弃上清，然后用保存液洗涤并稀释，分别得到QD655量子点微...

【专利技术属性】
技术研发人员：万东山，郭兰英，
申请(专利权)人：万东山，
类型：发明
国别省市：河南,41