蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法技术

本发明专利技术涉及蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法，包含以下自身抗原蛋白的蛋白标志物：P53抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.1sequence所示；SOX2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.2sequence所示；COPB1抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.3sequence所示；EFHD2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.4sequence所示；EIF4G3抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.5sequence所示；PCNA抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.6sequence所示。本发明专利技术可以非常方便、快捷、无创、高效地早期诊断或普查筛检肺癌疑似患者或肺癌高危人群。

Preparation and application of protein chip and protein chip diagnostic kit

The present invention relates to the preparation and application of protein chip and protein chip diagnostic kit, including the following protein markers of autoantigen protein: P53 antigen fragment, its characteristic amino acid sequence as shown in ID.1 sequence; SOX2 antigen fragment, its characteristic amino acid sequence as shown in ID.2 sequence; COPB1 antigen fragment, its characteristic amino acid sequence as shown in ID.3 sequence; The characteristic amino acid sequence is shown in ID.4 sequence, EIF4G3 antigen fragment is shown in ID.5 sequence, PCNA antigen fragment is shown in ID.6 sequence. The invention can be very convenient, fast, non-invasive and efficient for early diagnosis or screening of suspected lung cancer patients or high-risk groups of lung cancer.

【技术实现步骤摘要】
蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法本申请是申请日为2016年1月6日、申请号为201610007369.4和专利技术名称为“蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种用于早期诊断肺癌的基于6种肺癌相关自身抗原的自身抗体检测的蛋白质芯片，以及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒。本专利技术进一步提供了该蛋白质芯片以及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒在肺癌早期诊断、健康人群或肺癌高危人群的早期肺癌筛查中的应用。具体的，本专利技术涉及一种可用于血清学检测早期诊断人肺癌的蛋白质芯片，该蛋白质芯片可以通过检测6种肺癌相关的自身抗原在被检人血液样品中的各自的相应IgG型和IgM型自身抗体的相对含量，并联合分析这6种自身抗原相应抗体检测的结果，来判定被检人是否患有肺癌。进一步，本专利技术还涉及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒，这些诊断试剂盒均采用或包含了此蛋白质芯片。另外，本专利技术还涉及该蛋白质芯片及衍生的诊断试剂盒在早期肺癌诊断、健康人群或肺癌高危人群的早期肺癌筛查中的应用。
技术介绍
肺癌是全球死亡率和发病率最高的恶性肿瘤之一。根据美国癌症中心的最新数据，肺癌死亡率占癌症死亡总人数的27％，比常见的结肠癌，乳腺癌和胰腺癌死亡人数总和还要多。世界卫生组织在2001年曾经发布警告：在过去的10年中，全球肺癌的发病率每年以22％的速度在飞快上升，每年全球新增肺癌患者达120万人，死亡110万人。据北京市卫生局提供的统计数据显示，2010年肺癌位居北京市户籍人口男性恶性肿瘤发病的第一位，在女性中居第二位，仅次于乳腺癌。2001至2010年，北京市肺癌发病率增长了56％。全市新诊断出的癌症中有五分之一为肺癌。据流行病学专家预测，如果不控制吸烟和空气污染，到2025年，我国肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。现有临床相关数据显示，肺癌的5年存活率是16.6％，显著低于其他常见癌症，如结肠癌(64.2％)，乳腺癌(89.2％)和前列腺癌(99.2％)。肺癌的预后与其发展阶段紧密相关，局限性肺癌五年存活率为53％，而在出现转移的情况下五年存活率仅为4％。肺癌的早发现和早防治能显著提高患者的存活率和生活质量。然而，由于肺癌发展早期大多无明显症状，临床上只有10％-15％的肺癌能在早期被发现。由于早期肺癌病人无体征，因而到医院就诊的病人绝大多数是中晚期病人。提高早期肺癌、肺癌的诊断率，将亚临床肺癌或隐匿性肺癌从人群中筛查出来，对于提高肺癌的治愈率及降低死亡率具有重大的意义。目前肺癌的诊断主要分为2类：侵入性诊断和非侵入性诊断。侵入性诊断包括穿刺活检、手术探查等创伤性手段；非侵入性诊断包括各种影像学诊断手段(如X光胸片、CT、核磁共振、PET等)、细胞学检查，以及各种体液中某些肺癌或肿瘤标志物的检测。肺癌的侵入性诊断痛苦大，病人不愿意接受，一般只用于临床的鉴别诊断和确诊。肺癌最常用的诊断手段还是非侵入性诊断，在目前尤其是指影像学诊断和细胞学诊断。40年前胸部X光片就已作为早期肺癌的诊断和筛查手段之一，尽管这种技术费时，费用也高于细胞学检查，但确实能发现一些痰检阴性的早期肺癌，优于痰细胞学。但X光片通常只能检出大于1.5cm病灶的肺癌，而对更早期的肺癌、隐匿性、可疑肺癌及癌前病变均不能检出。自70年代英国科学家Housfield专利技术CT用于肺癌的诊断以来，先进的影像设备和技术的应用使得对早期肺癌的检出率也有所提高。近年来美国、日本一些发达国家将螺旋CT技术用于人群早期肺癌的筛查。1993年美国的早期肺癌普查方案对1000例自愿者高危人群采用低剂量螺旋CT筛查，发现233例有1-6个非钙化结节，其中27例确诊肺癌，早期肺癌23例(85％)，而同期X光片漏诊率为83％。随着医学影像学的发展，低剂量螺旋CT被广泛用于检测肺部早期结节。根据2011年6月发表在《新英格兰医学杂志》上的美国国家肺癌筛查临床试验数据显示，使用低剂量螺旋CT进行肺部筛查使高危人群的肺癌致死率降低了20％(AberleDR,etal.(2011)Reducedlung-cancermortalitywithlow-dosecomputedtomographicscreening.NEnglJMed365(5):395-409.)。因此，美国国家癌症研究所推荐低剂量螺旋CT是肺癌早期筛查的有效手段。同时，美国国家癌症研究所也明确指出，低剂量螺旋CT的问题在于其检测结果的高假阳性，而且多次CT检测还有可能加速肺癌的恶化。近几年发展起来的另一种新技术PET对肺癌诊断的敏感性和准确性又有进一步的提高。美国、日本、德国、加拿大等各国报道的结果显示，PET在分辨恶性与良性非钙化结节的敏感性、特异性均高于螺旋CT，可达85％和90％。但是，PET不能检出小于1.5cm的肺癌病灶，在早期肺癌的诊断上无显著优势，且设备价格更昂贵。综上所述，现有影像学设备和技术，在我国目前的国情下均不可能单独用于人群早期肺癌的筛查和诊断，需要联合其他肺癌早期诊断或筛查技术以解决假阳性率高和敏感性有时不高的问题。但它们在确诊早期肺癌中有一定的意义。支气管纤维镜检在肺癌诊断中的应用，主要是用于痰检和X光胸片发现异常或CT发现非钙化结节的病例，通过支纤镜检确定病变，并取活检组织或洗液，再进一步进行病理或细胞学确诊。通常对于有经验的大夫，支纤镜检可发现约30-40％的早期癌，难以检出癌前病变和原位癌。近年来出现了荧光支气管镜，有助于确定活检部位，发现早期肺癌，并有助于判断手术范围，同时还能检出癌前病变。美国、加拿大报道的结果显示，其原位癌和癌前病变检出率是普通白光支纤镜的几倍。但这一设备价格昂贵，对操作人员专业水平要求很高，检测费也贵，是痛苦有创性检测技术，对中心型早期肺癌和癌前病变，检出率较高，对周围型肺癌检出率低。因此这一技术和设备也不可能作为肺癌早期诊断和筛查人群的技术方法。痰细胞学检测技术阳性检出率低，中晚期病人的检出率为60-80％，而早期肺癌的检出率仅有10-20％。美国NCI的肺癌早期发现实验中，不足10％的肺癌是由细胞学单独发现。近年来国外发展一种新的痰细胞学检测技术(ThinPrep即液基超薄细胞电脑扫描技术)，目前已发展出第三代自动化设备AutocytePrepandAutoPap系统，该技术能制备出质量很高的超薄细胞片，从而提高痰检的检出率，对早期肺癌诊断的敏感性可提高到40-60％。但该技术需价格昂贵的进口设备，每份标本处理的试剂费为100元人民币，操作人员需较高的专业水平。国外主要在大医院里应用，用于人群早期肺癌筛查的报道甚少。国内目前仅有几个大城市的极少医院有此设备，开展了这项技术。因此，在我国现有国情下不可能用于肺癌早期诊断和大人群筛检。此外，该技术的致命缺点是对于周围型和边缘型早期肺癌检出率较低。随着分子生物学的迅速发展，在研究肺癌病因的同时，也在分子水平上对肺癌发生发展有了更多的了解。已有的研究表明在肺癌发生发展的多阶段过程中，细胞形态的恶性生物学改变伴随着其分子水平的多种基因参与和改变，它们包括癌基因的扩增、过度表达、突变和抑癌基因的缺失、突变、易位、重排等等多种基因的改变。到目前为止，已报道的与肺癌发生相关的基因异常改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质芯片，其特征在于：其包含由以下6种肺癌自身抗原蛋白组成的蛋白质标志物：(1)P53抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.1 sequence所示；(2)SOX2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.2sequence所示；(3)COPB1抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.3 sequence所示；(4)EFHD2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.4 sequence所示；(5)EIF4G3抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.5 sequence所示；(6)PCNA抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.6 sequence所示。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质芯片，其特征在于：其包含由以下6种肺癌自身抗原蛋白组成的蛋白质标志物：(1)P53抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.1sequence所示；(2)SOX2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.2sequence所示；(3)COPB1抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.3sequence所示；(4)EFHD2抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.4sequence所示；(5)EIF4G3抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.5sequence所示；(6)PCNA抗原片段，其特征氨基酸序列如ID.6sequence所示。2.如权利要求1所述的蛋白质芯片，所述的自身抗原蛋白质的蛋白标志物为重组表达纯化的蛋白质。3.一种包含如权利要求1所述的蛋白质芯片的诊断试剂盒；优选地，其还包括：检测玻片、检测校正玻片、样品稀释液、洗涤液和荧光二抗；其中，所述检测玻片由以下制备方法获得：在大肠杆菌中表达、纯化和分离含所述的6种抗原片段的特征氨基酸序列的重组蛋白或重组融合蛋白，使其纯度达到80％以上；在各抗原片段以及人IgG、人IgM中加入适量的生物素化的BSA，以适宜的浓度点样于经醛基化处理的玻璃基片上，将抗原共价交联于基片之上；采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后4℃干燥保存即得；所述检测校正玻片由以下制备方法获得：将人IgG及人IgM抗体标准品进行倍比稀释，选择适宜的浓度梯度点样于经醛基化处理的玻璃片基上，抗体标准品将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后4℃干燥保存即得；所述样品稀释液由含10％牛血清的PBS无菌过滤、装瓶即得；所述洗涤液由含0.02％Tween20的PBS无菌过滤、装瓶即得；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡海，马艳，
申请(专利权)人：广州市丹蓝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44