一种检测循环肿瘤细胞HER2、ER、PR的免疫荧光试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测循环肿瘤细胞HER2、ER、PR的免疫荧光试剂盒及其应用，本发明专利技术所述方法，检测原理如下：首先富集循环肿瘤细胞和其他稀有细胞，然后根据抗原抗体反应原理，采用免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的循环肿瘤细胞进行判读和计数。

An Immunofluorescence Kit for Detecting HER2, ER and PR in Circulating Tumor Cells and Its Application

The present invention relates to an immunofluorescence kit for detecting HER2, ER and PR of circulating tumor cells and its application. The detection principle of the method is as follows: firstly, circulating tumor cells and other rare cells are enriched, and then, according to the principle of antigen-antibody reaction, the expression of target protein in enriched cells is detected by immunofluorescence detection method. By fluorescent labeling of target cells and common antigen CD45 of leukocytes, and screening of target protein-positive and CD45-negative cells, this kit can interpret and count circulating tumor cells with specific protein-positive in blood.

【技术实现步骤摘要】
一种检测循环肿瘤细胞HER2、ER、PR的免疫荧光试剂盒及其应用
：本专利技术涉及一种医用检测方法，特别涉及血液中循环肿瘤细胞的检测，具体涉及人表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)蛋白免疫荧光检测试剂盒，适用于不同体液样本HER2、ER、PR抗原检测，还涉及该试剂盒在检测HER2、ER、PR中的用途。
技术介绍
：目前癌症发病率较高，严重威胁人类健康。有些癌症较难早期发现，诊断时多为晚期，如肺癌，结直肠癌，卵巢癌，胰腺癌等。相应的，晚期癌症的5年存活率显著低于早期患者，早发现早诊断精准治疗可显著延长患者的存活时间。人表皮生长因子受体2(Humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)、雌激素受体(Estrogenreceptor，ER)、孕激素受体(Progesteronereceptor，PR)是重要的免疫组化标志物之一。在包括乳腺癌、胃癌、肠癌、肺癌、子宫内膜癌等的其他多种恶性肿瘤中可检测到HER2蛋白的过表达。在包括乳腺癌、子宫内膜癌中也常有ER、PR的高表达。临床常根据HER2、ER、PR的表达状态为患者的临床治疗提供参考。以乳腺癌为例，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，年发病数占全球癌症新发病例数23％，死亡人数占14％，位居女性肿瘤发生首位(JemalA，etal.CACancerJClin，2011)。临床实践(OlivottoIA，etal.JClinOncol，2004)表明：当ER、PR表达均为阳性时，内分泌治疗药物三苯氧胺(Tamoxiefen，TAM)治疗有效率为60％～75％，而两者之一为阳性时(ER+PR-或ER-PR+)有效率下降至35％～50％，表明ER、PR表达与内分泌治疗疗效密切相关，其检测结果将直接决定治疗方案的选择。另一方面，在20％～30％的乳腺癌患者中存在HER2基因的扩增及其编码蛋白的过表达(SlamonDJ，etal.Science，1989)，对这些患者来说，内分泌治疗和标准化疗的治疗效果并不理想，抗HER2抗体药物可改善这部分癌症患者的预后。同样的在子宫内膜癌中，HER2、ER、PR的表达显示类似的结果。可选择类似的治疗方案对患者进行治疗。目前肿瘤诊断主要依赖于病理学、影像学和血清学三种方法。病理学是肿瘤诊断的金标准，但是组织取样具有一定的创伤性，且受限于取材部位，同时由于肿瘤组织的异质性，单点组织取样不足以反应整体肿瘤状态，且难以重复取样动态监测。影像学方法在诊断肿瘤中作用较广泛，但是影像学一般存在辐射伤害。而且，影像学通常只反应肿瘤大小等信息，难以判断肿瘤的恶性程度。更重要的一点，影像学通常只能检测2mm以上的肿瘤组织，对于较小的肿瘤组织诊断敏感性较差，存在滞后性。血清学目前通常用于辅助判断癌症治疗疗效等信息，取样较为方便，但是灵敏度和特异性较差，且与病理生理相关性差。同样的，在治疗方面，目前临床上也存在一定的局限性。对于肿瘤患者，特别是发生转移的患者，目前通常只依据原发灶的信息来判断治疗方案，忽略了对转移灶甚至微转移灶的检测与治疗。治疗过程中，目前主要通过影像学或血清学来判断治疗疗效，在疗效判断的精准性等方面存在一定的局限。以循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)为主的体液肿瘤细胞的检测可为上述局限性提供一些解决方案。CTC是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，CTC的检出提示体内原发灶或转移灶的存在，或癌前病变细胞的存在，是转移病灶形成的“种子”细胞，是肿瘤发生发展的直接证据。近年来不断有证据显示：在肿瘤发生发展的早期，甚至是影像学可见病灶形成之前肿瘤就播散入血了，这种播散可能存在于肿瘤发展的整个过程中。所以，对CTC进行检测有利于早期发现肿瘤、辅助诊断或为选择治疗方案提供参考。同时，对CTC进行动态检测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。目前，主要通过免疫组织化学方法对HER2、ER、PR表达水平进行检测。由于存在肿瘤异质性和微小转移灶不可见的原因，原位癌组织中HER2、ER、PR的检测并不能直接反映体液及转移灶中相关指标的表达。研究显示，HER2在乳腺癌组织和CTC中的状态并不一致，符合率约48％～97％(LeeJS，etal.BreastCancerResTreat，2016)；约有21％的乳腺癌患者，其转移灶中ER、PR的表达与原发灶不同(MacFarlaneR，etal.JClinOncol，2008)。组织中HER2、ER、PR的检测是在组织切片上进行，单张片子并不能反映患者整体的HER2、ER、PR表达水平且缺乏多种蛋白同时检测的结果。基于CTC对患者HER2、ER、PR表达水平进行检测，可预测患者对特定药物治疗的作用，为疾病治疗方案的选择提供参考，更好的指导临床应用。专利技术目的：本专利技术中的试剂盒可检测乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤患者CTC中HER2、ER、PR的表达水平来对患者的用药提供参考性的意见。目前肿瘤患者的HER2、ER、PR检测，主要是在组织上进行免疫组织化学检测。某些转移灶在很小的时候不易发现，而且存在有创、不能反复取样本进行检测、不能动态监测、单个组织样本不足以反映整体肿瘤负荷的缺点。本专利技术中通过免疫荧光技术对患者CTC中HER2、ER、PR的蛋白表达水平进行检测，可以更精准的反映患者的疾病负荷。并且可以反复取材、动态监测病情，从而为采取治疗方案提供更多的依据。AktasB等(AktasB.BMCCancer，2016)等检测了96例乳腺癌患者CTC的EpCAM、HER2、ER、PR等分子的表达，发现原发灶与CTC中HER2、ER、PR表达的一致率为59％(p＝0.262)、39％(p＝0.51)和44％(p＝0.62)，转移灶与CTC中HER2、ER、PR表达的一致率为67％(p＝0.04)，43％(p＝0.16)和46％(p＝0.6)。该研究用反转录PCR对HER2、ER、PR进行检测，RNA容易降解，而且无法识别单细胞中HER2、ER、PR的表达状态。
技术实现思路
：针对现有技术的不足，本专利技术提供一种检测HER2、ER、PR抗原的方法及其试剂盒。现有技术尚无采用免疫荧光方法同时检测CTC中HER2、ER、PR表达的报道。本专利技术所述方法，检测原理如下：首先采用已知的方法富集循环肿瘤细胞和其他稀有细胞，其中所述富集方法可以采用中国专利200810097889.4、201310057307.0、2015104411229中描述的方法。然后根据抗原抗体反应的原理，采用已知的免疫荧光检测方法，检测富集的细胞中目的蛋白的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对体液中特定蛋白阳性的CTC进行判读和计数。在此基础上，将目的蛋白阳性、CD45阴性的候选GTC按照目的蛋白荧光强度将其按照高、中、低表达进行分类。但将免疫荧光检测方法用于检测GTC中HER2、ER、PR表达在实践中遇到诸多困难，包括：细胞容易从玻片脱落、荧光较弱、非特异染色、基质背景高等。本专利技术经过多次筛选研究，最终得到一种适合的方法，解决了上述困难，同时在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测循环肿瘤细胞中HER2、ER、PR表达的方法，所述方法，步骤如下：1)循环肿瘤细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD‑G液，2)将富集的CTC进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，用CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的ER抗体、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；2.4)避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，2.6)复染：取10μL DAPI染液，加至标本区，2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或‑20℃环境下避光保存，3)对样本进行镜检观察将样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，4)结果判断阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种检测循环肿瘤细胞中HER2、ER、PR表达的方法，所述方法，步骤如下：1)循环肿瘤细胞的富集取血液和其他体液样品，对其中的循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell，CTC)进行富集，其中所述富集，方法可选用任何一种稀有有核细胞的分离富集方法，选自：红细胞去除、阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法、流式细胞技术等；也可以不经富集将血标本涂于多张载玻片，富集后的样本采用固定液固定，所述固定液选自：乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液、ECD-G液，2)将富集的CTC进行免疫荧光检测，免疫荧光检测方法步骤如下：2.1)CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；2.2)吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，用CYP1同上洗片3min×1次；吸去多余液体，加200μl冰丙酮：甲醇(7:3)作用5min，CYP1洗片3min×3次，吸去多余水分；2.3)加100～150μl封闭液室温封闭20～30min，吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的ER抗体、PR抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；2.4)避光，取CYP2100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；2.5)加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分，2.6)复染：取10μLDAPI染液，加至标本区，2.7)盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存，3)对样本进行镜检观察将样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察，4)结果判断阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞，阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭素杰，郭志敏，樊晓婷，
申请(专利权)人：北京莱尔生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11